回归化学的2018Nobel化学奖：酶的定向进化
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诺贝尓奖的创立者Alfred Bernhard Nobel本身是一位化学家。可是诺贝尓奖最喜欢搞跨界的就是化学奖，总喜欢颁给不那么化学的发现。111次的诺贝尔化学奖20+次颁给生物学（毕竟还是有一门交叉学科叫生物化学），20+次颁给物理学，甚至还有1次颁给农学。
2018年的诺贝尔化学奖一半授予美国科学家Frances H. Arnold，表彰她对酶开展的定向进化研究；另一半授予给美国科学家George P. Smith和英国科学家Gregory P. Winter，表彰他们对“噬菌体展示”的发明和应用（图1）。乍一看，今年又是生物学抢了化学奖的风头。其实不然，至少“酶的定向进化”某种程度上回归了化学的初心。
图1 2018年诺贝尔化学奖得主，引自诺贝尔奖官网
何为“酶的定向进化”？
大自然是这个世界上最伟大的化学家，而它最高阶的化学魔法就是生命。生物体从外界环境中摄取食物或者说原材料，在体内转化为维持自身生命活动需要的各种分子，这一过程中大自然也创造并不断进化着最神奇的化学反应催化剂——酶。那么，人类能不能改造酶来实现需要的化学反应呢？答案是肯定的。酶的本质是蛋白质，由20种不同的氨基酸组成。以前生物学界有句老话“一个基因一个酶”，基因决定了酶的氨基酸组成，只要修改了编码酶的基因DNA，就能够改变酶的氨基酸组成。
传统的学院派做法往往是：首先研究酶催化化学反应的分子机制，找到它识别结合反应物或者催化反应的关键位点，最好再加上高大上的结构解析和计算机分子动力学模拟，然后设计和构建酶关键位点的各种突变体，最后用实验验证酶的改造效果。这种流程非常符合生物化学的逻辑，但在新科诺奖得主Arnold眼里，效率太低，大概率是要失败的。
Arnold出生在一个核物理学家家庭，本科读的是普林斯顿大学机械与航天工程专业，博士在加州大学伯克利分校转到化工专业，博士后阶段又开始做生物化学的工作。这种跨界的背景让她能用一个全新的视角看待酶的改造工程。
她的选择看似有些简单粗暴：管他什么分子机制，把酶每一个氨基酸都突变一下，试试看有什么效果。问题是，就算一个简单的酶往往也有200-300个氨基酸，如果把每一个位点都变成其他19种氨基酸，算一下19200-19300种排列组合就知道几乎是不可能的。所以她使用了大自然另一个高阶魔法，进化！进化就是大自然设定了一个环境的标准，在物种的多样性中选择出更适宜环境的生命，淘汰那些不适宜环境的生命。Arnold的工作就是在实验室里对酶开展人工进化，简单来说有如下步骤（图2）：
图2 酶的定向进化的流程示意图 引自诺贝尔奖官网
1.在酶的DNA编码中随机引入突变；
2.把这些突变的DNA编码插入细菌里，让细菌生产带有不同突变的酶；
3.人为设定一个筛选标准，保留满足设定标准的酶突变体，而淘汰不满足标准的酶突变体；
4.对保留下来的酶突变体再进行下一轮的随机突变，如此反复循环只到找到最适应筛选标准的酶突变体。
Arnold用这种人工进化策略改造的第一个酶是枯草杆菌蛋白酶。这种酶能够切割降解其他蛋白质，但它只在水溶液中发挥功能，在有机试剂中活力极低。经过三轮上述“随机突变-筛选”的循环，Arnold在1993年找到一个突变体，在化工产业常用的有机溶剂（二甲基甲酰胺DMF）里的活力比它初始的模版提升了256倍。这个突变体包含了10多个位点的突变，其中很多并不是酶的催化活性位点或者底物结合“口袋”，用传统的学院派策略恐怕是很难找到这种排列组合的。这是酶定向进化第一次展示它的力量。
随后Arnold实验室地把这一方法成功拓展到更多的酶和化学反应上，使这些酶能耐受更严苛的反应条件，识别全新的底物分子，催化全新的化学反应。另一方面，酶定向进化的方法学不断改进，也有了长足的发展。不论是随机突变的引入，初始模版的选择，还是新选择标准和筛选策略的设立，Arnold实验室始终走在前列，引领着研究的方向。此外，2013年过世的荷兰科学家Willem P. C. Stemmer建立的DNA体外同源重组技术（DNA shuffling）对定向进化的效率提高也有重大贡献。
酶的杂泛性与定向进化
Arnold描述她的工作是在复制大自然的设计（copy nature's design process），与我们中国人讲艺术要“法自然，师造化” 有异曲同工之妙。
传统的思维里，酶的底物和催化反应被认为具有严格的特异性。然而近年来研究发现很多酶能催化不同于其天然的底物和化学反应的杂泛性。这种杂泛性是天然的客观存在，然而生物体在此时此刻可能并不需要酶的这种功能。随着环境变化给生物体带来新的生存压力，这种原本不需要的功能变成了生存的需要。突变可能会放大这种杂泛性，从而使得生物体在自然选择中获得优势。这就是进化，大自然最强大的力量。酶的天然进化使生物体拥有更特异更高效的催化剂，催化全新的化学反应来应对环境的压力和选择。
Arnold实验室的策略是发现酶分子新的杂泛性，并用定向进化加以放大，就是模仿大自然这种天然存在的力量，只是这一次的“进化”不再依赖盲目的自然选择，而是由人类的理性思考和意愿定向引导。
“酶的定向进化”有哪些应用？
酶的定向进化能够带来自然界原本不存在的全新化学反应。
细胞色素P450本身就是一类多功能的酶，图3左侧蓝色部分列出了能催化的天然化学反应。Arnold实验室运用酶的定向进化策略改变细胞色素P450的氨基酸组成，使其能够催化图3右侧粉色部分非天然的全新化学反应。
图3细胞色素P450催化的天然反应（蓝色）及其定向进化产生突变体催化的非天然反应（粉色）
引自Arnold FH (2015) The nature of chemical innovation: new enzymes by evolution. QRB 48:404-410.
酶的定向进化甚至能够带来自然界原本不存在的化学键。
尽管有硅基生命的猜想，人们至今还没有在自然界中发现过碳和硅两种元素间的共价连接。此前只有化学家通过人工合成获得碳-硅键连接。2017年Arnold实验室使用定向进化改造海洋红嗜热盐菌里的细胞色素C酶，使其成功将硅和碳键连起来，而且把此前人工合成的反应效率提高了15倍。
酶的定向进化给化工产业也带来革命性的变化。
定向进化改善了酶对有机溶剂的抗性、热稳定性、对非天然底物的亲和力等性质，从而使其能满足工业生产的需要。前面提到经过定向进化改造能在化工溶剂DMF中工作的枯草杆菌蛋白酶就是这样的例子。今天，定向进化开发的酶已经广泛用于生物燃料，化学品材料和药物的工业生产。另一方面，使用定向进化开发的酶用较温和的生物技术取代了苛刻的工业过程，不再需要有毒的重金属或大量有机溶剂，提供了一种清洁绿色的全新工业模式。
“酶的定向进化”的化学属性
以前一些让人觉得“很生物”的诺贝尔化学奖往往是揭示特定生命活动的化学反应本质，本质上还是一个生物学的问题。
不可否认，“酶的定向进化”是一项生物技术，但它的核心却是利用生物技术去设计和实现全新的化学反应，解决化学合成和化工产业的问题，所以具有更多的化学属性。当被问到“如何用简单通俗的语言总结获奖发现的意义”时，主持化学奖颁奖发布会的瑞典皇家科学院秘书长Gran K. Hansson总结说，酶的定向进化是一种“更安全、更绿色的化学”。虽然“酶的定向进化”穿着生物技术的外衣，却不妨把它看作是诺贝尔化学奖跨界后的一种回归。
其实，“跨界”、“回归”都只是玩笑话，科学没有那么多的门户之见。诺贝尔的遗愿和诺贝尔奖设立的初衷是为了奖励那些“为人类做出最大贡献”的人，而建立的“酶的定向进化”Arnold无疑是其中的杰出代表。当被诺贝尔奖官网记者问到研究生涯最有趣的发现是什么时，她回答说：“最有趣的永远是我正在进行的研究”，而目前她最感兴趣的是如何进化创新本身。让我们拭目以待!
参考文献
Chen K, Arnold FH (1993) Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:5618-5622.
Stemmer WP (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 91:10747-10751.
Arnold FH (2015) The nature of chemical innovation: new enzymes by evolution. QRB 48:404-410.
Kan SB, Lewis RD, Chen K, Arnold FH (2016) Directed evolution of cytochrome c for carbon-silicon bond formation: Bringing silicon to life. Science 354:1048-1051.
Arnold FH (2018) Directed evolution: bringing new chemistry to life. Angew. Chem. Int. Ed. 57:4143-4148.
