方 案 2. 14 由 h E S 细 胞 产 生 胚 胎 样 小 体 试剂与材料 无菌或无菌制备 □ 生 长 于 M E F s 之上的未分化的 h E S 细胞集落 □ 加样器,设置在 50ul □ 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿(特 殊 包 被 过 的 皿 ,可 防 止 细 胞 附 着 ;见 2.9节) , 2. 6 cm。 □拉长的玻璃吸管(见方案 2.7) 非无菌 □ 带 有 37°C 加热台的解剖显微镜 步骤 (a) 在 超 低 附 着 力 的 P e tri 培 养 皿 中 加 人 2〜3 ml h E S 培 养 基 。 (b) 从温箱中取出未分化的 h E S 细胞,放在解剖显微镜的加热的台子上。 (C) 用拉长的玻璃吸管(见方案 2. 7) 将集落切成小块,块的大小大约与hES细胞手工传代切的大小(300〜500 个细胞)相同,要小心解剖,只取未分化的细胞。 (d) 当集落的所有合适的区域都被分离,得到足够的细胞小块时,收集所有漂浮的小块转移至低附着力的培养皿中,细胞团块而后将形成自由漂浮的细胞球体—- 胚胎小体(Ebs) (图 2. 4)。 (e) 第二天早上检查一下这些 Ebs, 确认它们没有贴附在皿底,如果贴附了,可以用拉长的玻璃吸管小心地使它们移动,可以自由漂浮。 (f) 在 标 准 h E S 培养基中孵育这些 Ebs 3〜5 天,每天补充 lm l 培养基 展开 |