构建硫氧还蛋白肽适配体组合库实验
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 用自动 DNA 合成仪合成如下的 91-碱基的随机寡核苷酸和 17-碱基的引物。分别用水溶解使其终浓度为 1 ug／ul。 寡核苷酸 ： 5'-GACTGACTGGTCCG （NNK）20GGTCCTCAGTCAGTCA-3'。此处 N 代表 A，G，C 或 T； K 代表 G 或 C。 引物：5'-CTGACTGACTGAGGACC-3'。 2. 按顺序加入下列试剂到一 1.5 ml 离心管中（终体积 890 ul）： 200 ug 引物（过量 10 倍） 100 ug 随机寡核苷酸 490 ul 水 100 ul 10×Klenow 聚合酶反应缓冲液。 3. 水浴中加热样品到 95℃，孵育 5 min，然后让温度缓慢降到室温（约 30 min） 以使引物与随机寡核苷酸复性。 4. 加入 90 ul 5 mmol／L 4dNTP 混合物和 20 ul（100 U）Klenow 聚合酶，于 37℃ 孵 育 3 h。 5. 用苯酚／氯仿抽提反应混合物，乙醇沉淀 DNA。 6. 用 0.8 ml 水溶解 DNA 沉淀。 7. 加入 100 ul 10×Ava II 反应缓冲液和 100 ul （1000 U）Ava II。37℃ 孵育 4 h。 8. 重复步骤 5 操作。 9. 用 150 ul 10 mmol／L Tris·Cl， pH 8 溶解 DNA 沉淀，加入 50 ul 体积的非变性上样缓冲液。 10. 用预制的 10％ 非变性聚丙烯酰胺胶电泳分离 DNA。 11. 用紫外照射定位 DNA 条带并切下该条带。 12. 将胶条浸泡于 DNA 洗脱缓冲液中振荡过夜以从胶中洗脱出 DNA。 13. 乙醇沉淀 DNA 并溶解于 200 ul 10 mmol／L Tris·Cl， pH 8 中。用紫外分光光度计测定 DNA 浓度，或用 EB 斑点定量估计 DNA 浓度。 14. 选择一种硫氧还蛋白表达载体（pJM），于 420 ul 无菌水中加入 12 ug 所选载体。 15. 加入 50 ul 10×Rsr II 反应缓冲液和 30 ul（60 U）Rsr II 酶 37℃ 孵育过夜。 16. 加入 10 ul （100U） CIP 并于 37℃ 孵育 1 h 以使 II 酶切过的 PJM 载体去磷酸化。 17. 用 PCR 纯化柱或苯酚／氯仿抽提纯化去磷酸化的、Rsr II 酶切过的 pJM 载体。 18. 将 8 ug DNA 片段（步骤 13 与 12 ug 载体（步骤 17）合并加入到水中至终体积为 860 ul。 19. 加入 100 ul 10×T4 DNA 连接酶反应缓冲液和 40 ul （80 000 U） T4 DNA 连接酶。 16℃ 孵育 16 h。 20. 用 QIAquick 胶回收试剂盒并按照厂家的操作说明纯化连接好的 DNA。用 30 ul 超纯水将 DNA 从柱上洗脱下来。 21. 冰上融化 350 ul 电转化感受态的 E.coli MC1061， 加入 300 纯化的连接质粒，混合后转入 0.2 cm 间隙电转杯中。 22. 用如下条件进行电转：2.5 kV，200 Ω， 25 uF 。 23. 加入 25 ml 预热的 SOC 培养基并于 37℃ 轻轻摇荡 1.5 h 使细胞复原。 24. 进行一系列稀释然后涂布含 50 ug／ml 氨苄青霉素的 LB 平板以确定转化效率。 25. 将剩余细胞转到 1 L LB 液体培养基中（含 50 ug／ml 氨苄青霉素）并于 37℃ 孵育过夜。 26. 用大规模质粒制备试剂盒或连续的溴化乙锭／CsCl 密度梯度离心纯化质粒 DNA。测定浓度并调整为 40 ug／ml 以用于筛选。 展开 |
| 注意事项 | 酶的活性单位是针对购自 New England Biolabs 的酶。也可以使用来源于其他厂家的酶，但活性单位需要另行确认。 |
| 其他 | 1. 材料 E.coli MC 1061 （Bio－Rad）， 电转化感受态 硫氧还蛋白表达载体质粒：pJM－1、pJM－2 或 pJM－3 DNA 洗脱液 2. 试剂 5 U／ul Klenow DNA 聚合酶和 10×反应缓冲液（New England Biolabs） 2000 U／ul T4 DNA 连接酶和 10×反应缓冲液（New England Biolabs） 10 U／ul 小牛肠碱性磷酸酶（CIP） 和 10×反应缓冲液 （New England Biolabs） 5 mmol／L 4dNTP 混合物：各 5 mmol／L 的 dTTP、dATP、dGTP 和 dCTP 10 U／ul Ava II 和 2 U／ul Rsr II 限制性内切核酸酶和 10×反应缓冲液（New England Biolabs） 10 mmol／L Tris·Cl， pH 8 非变性上样缓冲液 超纯水（可选冲洗用的灭菌水；Fisher Scientific） SOC 培养基，预热到 37℃ LB 平板和液体培养基， 含 50 Mg／ml 氨苄青霉素 3. 耗材 QIAquick 胶回收试剂盒（Qiagen） 大规模质粒制备试剂盒（许多商家有售，如 Qiagen； 可任选） DNA 合成仪 16℃ 和 95℃ 水浴 PCR 纯化柱（如 Qiagen； 可任选）电转仪（如 Bio－Rad Gene Pulser），带 0.2 cm 间隙电转杯 |
