叶绿体mRNA3’末端的体外加工

l      RNA加工反应

1．在1.5ml微量离心管中加入下列反应液：

缓冲液IVT（20×）                            0.5μl

叶绿体蛋白提取物（20μg）                      Lμl

缓冲液E                                       Mμl

（L＋M＝5μl）

DEPC处理过的水                                Xμl

H-RNA（约0.25fmol，每分钟计数2000）           Yμl

（X＋Y＝4.5μl）

以加入H－RNA起始反应，温和混匀，短暂离心使反应液从管壁上甩下来。

注：

缓冲液IVT（20×）：200 mmol/L KCl, 75 mmol/L MgCl2, 40 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）  用DEPC处理后高压灭菌。

缓冲液E：20 mmol/L HEPES（pH7.9），60 mmol/L KCl, 12.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 2mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），17％甘油   用DEPC处理后高压灭菌。

2．25℃温育60分钟（或对于动力学实验为0～60分钟）。

3．将5μl反应液中移入45μl终止液以终止反应，混匀，置于冰上。

终止反应液：

6 mol/L 尿素

1％十二烷基硫酸钠（SDS）

4.5 mmol/L 玫瑰红三羧酸   

用DEPC处理并高压灭菌

4．加入50μl酚/氯仿/异戊醇（25：25：1），混匀，室温下离心2分钟。把上层水相（红色）移到新离心管中，弃掉酚相。

5．再加入1μl 3mol/L乙酸钠（pH5.5），1μl 10mg/ml tRNA，125μl 100％冰冷乙醇。－20℃放置10分钟后，4℃离心10分钟。

6．小心移去上清，将RNA沉淀真空干燥约5分钟后，重悬RNA于7μl甲酰胺染液中。

7．沸水浴煮RNA重悬液3分钟，冰上快速冷却。

l      用PAGE分析RNA产物

1．准备电泳装置，用洗涤剂洗玻璃板（450px×450px×2px），依次用水，蒸馏水和乙醇冲洗，然后空气晾干。

2．制备6％丙稀酰胺凝胶液：

溶液A                                    4.8ml

溶液B                                    7.2ml

APS（20％）                              55μl

TEMED                                    8μl

倒胶，插入梳子，丙稀酰胺将30分钟内完全聚合。

注：

溶液A：5×TBE（用10×TBE贮液），7 mol/L尿素，15％丙稀酰胺，0.75％双丙稀酰胺

溶液B：0.5×TBE（用10×TBE贮液），7mol/L尿素

3．电泳缓冲液为0.5×TBE，30mA下，预电泳直到温度上升为50℃或电压上升至1000V（需要约20分钟）。

4．用电泳缓冲液冲洗泳道以除去预电泳中扩散汇集于泳道的尿素。上RNA样，在20mA下走胶至溴酚蓝到达胶的底部（20～30分钟）。

5．小心地分开上下玻璃板，把胶移到Whatman 3MM纸上，盖上Saran^®膜，再放上一层Whatman 3MM纸于Saran^®膜上，置于凝胶干燥器上干燥。

6．用增感屏于－80℃，干凝胶X光片曝光6～15小时。

蛋白质与RNA的交联

l      UV交联反应

1．在1.5ml微量离心管中加入下来反应物（X-RNA除外）：

缓冲液IVT（20×）                              0.75μl

叶绿体蛋白提取物（20μg）                         Lμl

缓冲液E                                          Mμl

（L＋M＝7.5μl）

poly（U）（0.1mg/ml）                              1μl

DEPC处理过的水                                  Xμl

X-RNA（约1.25fmol,每分钟计数100 000）            Yμl

（X＋Y＝6.5μl）

总体积：                                       15.75μl

室温下放置5分钟，加入X-RNA，温和混合，短暂离心，将反应液从管壁上甩下来。

2．室温下放置10分钟。

3．小心地打开管盖，放至UV交联仪下，在工作功率1.8J（即刻度为2×9000）进行UV交联，如果没有UV交联仪，可在杀菌灯下150px照30分钟。

4．加入1μl 0.5mg/ml RNase A液，在37℃温育20分钟。

5．加入4μl×Laemmli样品缓冲液，在80～100℃下处理样品1分钟。

l      蛋白质的SDS－PAEG电泳分析

1．准备制胶装置，洗玻璃板，可选用450px×450px×2px玻璃板或200px×250px（微型凝胶）玻璃板。

2．制备13％丙稀酰胺分离胶溶液：

丙稀酰胺（30％）/双丙稀酰胺（0.8％）               8.7ml

H₂O                                              8.8ml

分离胶缓冲液（8×）                               2.5μl

APS（20％）                                       75μl

TEMED                                           30μl

3．制备浓缩胶溶液：

丙稀酰胺（30％）/双丙稀酰胺（0.8％）                1.3ml

H₂O                                               3.9ml

浓缩胶缓冲液（4×）                                1.8ml

APS（20％）                                        45μl

TEMED                                             10μl

4．在20mA直流下电走胶直至溴酚蓝到达胶的底部（2～3小时）。

5．小心分开玻璃板，把胶移入玻璃皿中，按下列程序银染蛋白。

l      阳性成像银染

按Merril等1984的方法，下述的步骤均在室温下进行。

1．在含有50％甲醇/12%冰乙酸的400ml水溶液中处理10分钟以固定凝胶。换用新溶液重复一次。

2．在含有10％甲醇/5％冰乙酸水溶液400ml中处理10分钟以漂洗凝胶。换用新溶液重复一次。

3．将胶浸入含3.4mmol/L重铬酸钾/3.2mmol/L硝酸200ml水溶液中15分钟。

4．将胶浸入含12mmol/L硝酸银的150ml水溶液中，放置15分钟。

5．用水漂洗3次。

6．在含有0.5ml 37％甲醛溶液的0.28mol/L碳酸钠150ml溶液中快速洗胶两次后，换上150ml新鲜溶液，让凝胶显像3～15分钟。

7．去掉显像剂，加入200ml 3％乙酸水溶液，放置5分钟终止显像。

8．用5％甘油200ml水溶液漂洗成像凝胶10分钟。

9．在约80℃凝胶干燥器上干燥成像凝胶，用增感屏－80℃对X光片曝光过夜。