流式细胞仪检测实验-用TUNEL流式细胞定量凋亡细胞
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | PBS95%乙醇（不是100%乙醇）冰冷多聚甲醛固定液TdT反应液TdT 生物素-dUTP混合液异硫氰酸荧光素（FITC)-链霉亲和素（streptavidin)结合物 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1a)多色分析：进行免疫荧光染色。重悬染色细胞于PBS，转移含5×105个细胞的细胞液至一 12 mm×75 mm圆底离心管。必须确保用于多色染色的荧光团没有被TUNEL步骤的固定剂破坏。FITC、PE和Texas红不受影响。 Duochromes (PE和Texas红的结合物，如Red 613)也不受影响，但是别藻蓝素（APC)会被固定剂破坏。 1b) TUNEL检测：转移含5 ×105的细胞液至一 12 mm×75 mm圆底离心管。 2)加入1〜2 ml PBS,然后 4℃，300 g (IEC 269转子则为1200 r/min)离心5 min 沉淀细胞，弃上清。重悬沉淀于250μL PBS，然后边轻柔涡旋振荡边5〜10 s—滴一滴地加入750μL冰冷的95%乙醇。4℃孵育20 min。 3)加入2 ml PBS洗涤细胞，4℃，400 g离心5 min。弃上清。 4)倾斜试管用余下的缓冲液重悬细胞，边轻柔涡旋振荡，边间隔5〜10 s滴加入1 ml多聚甲醛固定液。室温孵育30 min。 5)按步骤3同样用PBS洗涤细胞，如果需要可于4℃暗室储存几天。 6)按步骤3同样洗涤细胞，用0.5 ml TdT反应液替代PBS。弃上清后立刻反转试管口于吸水纸上，以此尽可能多地弃除上清。 7)加入50μL TdT/生物素-dUTP混合液到细胞沉淀里，于37℃孵育45 min。 8)按步骤3同样用PBS洗涤细胞，然后加入10μL FITC-链霉亲和素结合物（以制造商推荐的稀释液）。室温孵育30min，然后按步骤3用PBS洗涤细胞。 9)进行流式细胞仪分析 展 |
