轻松消除驻留体积的影响
驻留体积及其对分离的影响是困扰色谱分析人员的一大难题。通常在驻留体积不等的仪器上使用同尺寸的色谱柱会有一系列问题，另外，将方法在各个实验室之间转换时，即便使用同一台仪器，要更改色谱柱尺寸和体积，驻留体积仍然是个问题。本文介绍了采用ISET技术应对这一系列挑战的解决方案。
驻留体积的定义
驻留体积是指溶剂首次混合点（通常在液相色谱仪的混合腔内或比例阀中）与液相色谱柱头之间的体积。其中，低压混合系统的驻留体积等于从比例阀经泵和其他系统组件到柱头的体积总和（见图1）。高压混合系统的驻留体积等于从溶剂首次混合点，经过两个计量泵再到柱头的体积总和（见图2）。
在等度分离中，驻留体积对保留时间没有任何影响，而在梯度分离中则会造成重大影响。若不了解系统的驻留体积，可能会带来严重影响，因为驻留体积有可能远大于色谱柱体积。
相同色谱柱，不同仪器
若想在不同仪器上使用相同尺寸的色谱柱，往往需要考虑驻留体积这个问题，因为不同驻留体积的仪器使用同一方法也可能影响分析结果。在柱头开始梯度洗脱时，需要确保通过色谱柱的流动相体积相同。如果流动相的体积不相同，结果也将不同（见图3）。
若在两个实验室内对不同驻留体积的 HPLC 仪器使用相同的方法，运行结果很可能不完全相同，因为两种（或多种）流动相混合形成梯度后，将在各个仪器的流路内经过一段不同的时间后方能到达柱头。因此，进样后受时间影响，分析物将通过不同的流动相组分，其保留时间和分离度也会受到影响。如果将梯度方法从一台仪器转移到另一台仪器，保留时间会根据两个系统的驻留体积发生变化。流路体积越接近，结果的一致性越高。
结果如有差异，可采用多种方法加以纠正。若仪器的驻留体积较小，可以通过增加仪器的体积来调节驻留体积；若仪器的驻留体积较大，可以减小仪器连接管线的内径和长度。此外，还可以在该方法中设置梯度延迟，以补偿流路系统中的不同驻留时间。
安捷伦1290 Infinity系统采用智能化系统模拟技术（ISET），可以轻松解决上述问题。ISET在1290 Infinity 液相色谱仪上模拟安捷伦或其他液相色谱系统的不同延迟体积和混合行为，无需手动更改方法或硬件，即可提供与原仪器或原方法相同的分析结果（注：某些认证方法可能不允许分析中使用这种改变）。
相同仪器，不同尺寸的色谱柱
更改单个仪器上的色谱柱直径和色谱柱体积前，应当考虑其对分离的影响。为了确保实验条件相同，更改色谱柱内径时需要对色谱柱体积的差量作出补偿。
假设仪器的驻留体积为1 ml，若 2.1×100 mm 色谱柱的体积为0.2 ml，流速为0.2 ml/min，那么柱头开始梯度洗脱需要5 min（即5个色谱柱体积）。这实际上就是梯度开始前色谱柱经历的等度保持。若换用更大体积的色谱柱，例如体积约为 1 ml 的 4.6×100 mm 色谱柱，流速为 1 ml/min，则驻留体积可能仅约为1个色谱柱体积。
要在 4.6 mm 的色谱柱上模拟与更小色谱柱的相同条件，则需要增加一个等度保持。采用该方法，只需根据色谱柱内径的变化对梯度条件作出相应的调整，在柱头开始梯度洗脱前，4.6 mm 的色谱柱将具有等量的柱体积。
小结
驻留体积及其对分离的影响，是色谱分析人员在日常工作中经常面临的问题，尤其在梯度分离中，可能带来严重的影响。采用智能化系统模拟技术（ISET）的安捷伦1290 Infinity 系统，能帮助分析人员轻松解决上述因驻留体积及其对分离影响带来的难题。
