雄性Wistar大鼠

DMEM 胎牛血清 内皮细胞生长因子 肝素钠 青链霉素 明胶 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液

手术器械 眼科剪 眼科镊 培养皿 手术刀 培养瓶 CO2培养箱

一、实验方法
1. 颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1  min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。

2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。

3. 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm³ 大小的动脉植 块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜， 使用前2  h 移入CO₂培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为 1 块/cm² 。

4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24 h 后，更换培养液，加入 2-3 ml 培养液。

5. 72 h 左右的时候，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮除成纤维细胞，换培养液1 次。以后每2 天换液一次，每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d， 细胞融合成单层，即可传代。

二、实验结果

植块培养法进行的原代培养，一般在培养2-3 天，动脉植块周围即有细胞生长，并渐向外延伸，呈扁平短梭形或多角形；约8-10 d 后细胞融合成片。采用vWF 免疫组化鉴定，主要表达在细胞浆中。

一、实验讨论

植块培养法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。

而由于成纤维细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。因而，抑制和减少成纤维细胞是大鼠主动脉内皮细胞培养的关键问题。本法采用的方法是：

   
1. 在合适的时间去除动脉块，即当内皮细胞已经爬出，初具规模时(大概在72 h 左右的时候，按照本文的培养液条件，因为有生长因子，内皮容易爬出和增殖)，去除动脉块，并刮除成纤维细胞。

2. 使用含肝素的培养液(在培养液中加入100 U/ml 的肝素)，可使内皮细胞纯度提高；

   
3. 高浓度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促进内皮细胞增殖，而使内皮细胞成为优势细胞。另外，动脉植块干贴壁的时间不宜超过2 h，而加培养液这一步骤尤为关键，过少会使内膜接触不到培养液，过多则易使动脉小块漂浮，导致贴壁失败。因此，干贴壁后加培养液，加入少量高营养的培养液(0.5-1 ml)，可以避免这些问题。

组织块贴块的时候，不可避免会有一些块贴的方向不是内膜面，那么最后将爬不出内皮，甚至长出较多杂质细胞，需刮除。

另外，部分块即使大小合适，方向也正确，也可能爬不出来，去除组织块的时候，应该以大局为重，看到内皮细胞已经爬出较多，而杂质细胞也开始爬出的时候，就要果断地去除组织块了。72 h 只是个大概的时间，初学者不可以拘泥。