多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和使用——用于...（三）

说明

(1) 用 IntegraCL350 瓶培养杂交瘤细胞的效果很好, 每毫升细胞培养收获上清液中，可以得到 mAb0.5~Img。通常可连续培养 1 个月左右。

(2) 处理液体：将培养基在 37°C 水浴预热。这有助于避免培养瓶中的冷凝作用以及细胞的温度休克向细胞培养皿 (白盖) 添加或取出液体时, 要先拧松营养培养室的绿盖，以防止留有空气。放人培养箱孵育之前始终拧紧培养瓶的白盖和绿盖。建议使用 IOmL 血清移液管进行操作。将培养基吸出并加人新鲜的培养基, 为营养维持室换液。

(3) 接种的最低细胞浓度为 1.5X106 个细胞/mL[步骤 (2)]。我们尝试降低营养培养基中所需的胎牛血清，但未获成功。一些市场上的新型无血清培养基可以用做营养培养基。

(4) 监测细胞数量和状态很重要 [步骤 (3)]。有助于确定是否分离细胞，以减少细胞数量，避免总活细胞数大于 I.OXlO8 个。如果细胞活力大大降低，则需要增加换液频率。

(5) 在连续培养过程中，由于每次收获均分离细胞，引起细胞死亡而导致活细胞比例 [步骤 (4)] 下降。培养期末, 仅有 30%~40% 活细胞是非正常终止的。

(6)—些杂交瘤细胞在长期连续培养时是不稳定的, 并失去产生抗体的能力。因此，在培养期间应监测抗体生成。我们采用标准 ELISA 检测。

(7)CELLine 培养瓶的信息可以在 www.integrabiosciences,COM/celline 获得。

5.抗体纯化

为将抗体与载体上可用反应位点间的结合最大化, 需要纯化抗体，至少部分纯化也是有益的。可以用多种不同的方法纯化抗体。其中最经济实用的方法是分子排阻色谱或离子交换层析。常用的纯化方法是利用 ProteinA、ProteinG，或两者混合进行亲和层析, 但这种方法耗费较髙。小鼠 111 八 1) 属于免疫球蛋白化 04 个亚类之一：^0 1、：^02&、龟 02 匕和 IgG3。小鼠 IgG2a、IgG2b 和 IgG3 可以用 ProteinA 层析柱纯化。小鼠 IgGl 与 ProteinA 结合的效果差。与小鼠 IgG2a 不同，小鼠 IgGl 与 ProteinG 结合效果更好，而 IgG2b 与 ProteinA 和 ProteinG 均可结合。

根据我们的经验，大部分典型融合实例中的单抗都是 IgGl 亚类。这里我们介绍一种 DEAE 柱 (WhatmanDE52)，可以用于纯化小鼠 IgGmAb，该层析柱既经济，又简单。

对于 mAbIgGl, 这种方法特别有效。事实上，在我们的操作中，每个纯化后的 igG1mAb，经检测纯度均可达 90% 左右。此外，许多小鼠的 IgG2a 和 IgG2b 抗体可以通过这种方法纯化。

(1) 无论是腹水或 CELLine 细胞培养上清液中的抗体均需采用硫酸铵沉淀。向 mAb 中加饱和硫酸铵溶液至奶％ 饱和度。冰上搅拌浆体 2 0 min。通过这种方式沉淀 mAb，同时大部分血清白蛋白留在溶液中。

(2) 离心分离沉淀 (约 6000 尽,10 min)。向沉淀中加入抗体用缓冲液 [50 mmol/LTris-HCKpH6.9),25 mmol/LNaCl], 加入量为抗体初始体积的 l/4(CELLine 培养瓶制备抗体).1/2(腹水)。

(3)15 min 左右可溶解沉淀，离心使其澄清 (约 6000IOmin)。

(4)4°C 条件下，将步骤 (3) 得到的上清液用 IL 抗体用缓冲液透析过夜。

(5) 澄清的上清液用于 DE52 柱层析，按照下面「说明」中事项准备层析柱。层析柱用抗体用缓冲液 (pH6.9) 平衡, 该 pH 条件下，大部分 mAb 流穿，而多数杂质会与层析柱结合。10 mL 原料可用 5 mLDE52 柱。

(6) 收集原料中未与层析柱结合的组分 (约 ImL)，每个组分样品进行 SD&PAGE 检测。CL350 培养瓶制备 mAb8RB13(IgGl 型单抗），纯化产物的 SDS^PAGE 结果如图 28.2B 所示。根据抗体纯度合并分离组分。

(7) 用 5 mL 含 0.5mol/LNaCl 的抗体用缓冲液洗脱层析柱,PAGE 分析前保存洗脱液。

说明

(1)DE52 的准备工作十分重要。虽然生产商宣称不需要预循环, 但是我们证实预循环大大改善了色谱性能。10 g 树脂混悬于 100 mL 水中, 并用 100 mL 水清洗数次, 每次清洗可去除细小物 (不沉降的小颗粒)。然后用 100 mL0.Imol/LHCl 处理树脂 30 min, 将 HCl 缓慢倒出。至少清洗 3 次树脂, 每次用 100 mL 水。最后一次清洗缓慢倒出液体，然后用 0.Imol/LNaOH 处理树脂 30 min, 缓慢倒出液体，至少清洗 3 次树脂，每次用 100 mL 水。用抗体用缓冲液清洗树脂 3 次，每次用 100 mL 缓冲液, 并用相同的缓冲液悬浮。用 pH 试纸检测 pH，加人叠氮钠至终浓度 0~ 0 2%。树脂分装于一次性试管，存放于冰箱内。

(2)mAb 可来源于腹水。虽然腹水并不纯 (纯度 80%~90%), 但杂质可能并不影响免疫亲和树脂的性能。

(3) 在上述条件下，大多数小鼠 mAb 可流穿 DE52。但仍有少量 mAb 可以结合于层析柱。因此，可以采用高盐洗脱条件 [步骤 (7)] 洗脱抗体。使用盐梯度浓度纯化与 DE52 层析柱结合的 mAb 是必要的。

(4) 如果以 CELLine 培养瓶制备 mAb，可不必采用 DE52。

6.PR-mAb 在层析载体上的固定

供应商提供了很多种树脂和偶联剂。我们已经对其中的大部分进行了验证，但没有任何一种比用溴化氰 (CNBr) 衍化的交联琼脂糖更有效。

（1）纯化后 mAb 用偶联缓冲液透析 (1 00 mm o l/LNaHCO3、500 mmol/LNaCUpH8.3)。移出透析管中的抗体溶液，并用偶联缓冲液调整其体积，每克溴化氰活化的 Seph-arose 干粉对应 10 mL, 留样 (约 1 00^L) 分析蛋白质浓度。

（2）约需 20 min 溴化氰活化的 Sepharose 干粉即可溶胀于 0.Immol/LHC1。每克溴化氰活化树脂干粉可制备 3.5 mL 凝胶。然后在玻璃滤器内清冼树脂，每克树脂用约 100 mL0.Immol/LHCl。

(3) 用约 20 mL 偶联溶液快速清洗树脂后，将树脂转移至抗体溶液中。23°C 条件下，用实验室旋转器将胶浆液翻转混合 2 h。

(4) 用玻璃过滤器收集树脂, 保存滤液用于测定未偶联蛋白质含量。

(5) 将树脂转移至约 1 0 1111^1”[8.3、1111 0 1/1 乙醇胺溶液中,23。(：翻转混合 211, 使乙醇胺与残余的溴化氰充分反应。

(6) 再次用玻璃过滤器收集树脂，偶联缓冲液 (约 50 mL) 清洗后，用 100 mmol/L 乙酸钠缓冲液 (pH4.0) 清洗。

(7) 重复至少 2 次或 3 次步骤 (6) 中的 2 次清洗。

(8)4°C 条件下，将偶联的 Sepharose 保存于 I0 mL 含 0.02%NaN3 偶联缓冲液中。

(9) 检测结合前后保存的抗体溶液 [步骤 (1) 和 (4) 得到的样本] 中的蛋白质含量。据此确定偶联效率。

说明

(1)Ig 树脂干粉制备 3.5 mL 溶胀树脂。我们发现多数情况下，—次处理 0.5~2.0 g 树脂干粉比较方便。并且证实 ImL 溶胀树脂偶联 2.5 mgmAb 效果较好。因此，3.5 mL(lg) 树脂需要结合 8.75 mgmAb。

(2) 溴化氰活化的 pH 条件是 8 以上。因此, 上述步骤 (3) 中的抗体溶液应尽快转移至树脂。

(3) 阻断剂 [步骤 (5)] 可依据具体使用目的而异。例如, 产自酵母的乙醇胺结合蛋白，如果用乙醇胺作为阻断剂，将会与目标蛋白质共纯化。在这种情况下，almol/L 甘氨酸是比较合适的阻断剂。

(4)4°C 条件下，将树脂储存于 0. 0 2%NaN3 中。该条件下，树脂可以稳定储存约 6 个月。我们注意到，一些抗体储存 6 个月后会发生剥离。向上述缓冲液中加入 50% 甘油，存储于 20°C(不冻结），可能延长半衰期。

7.用 PR-mAbs 纯化蛋白质

下面我们以 mAbNT73 或 8RB13 纯化大肠杆菌来源的 RNA 聚合酶为例。前面介绍一步免疫亲和层析法可以得到纯度约 90% 的 RNA 聚合酶。其他一些与 RNA 聚合酶结合的蛋白质也会被共同洗脱。该操作规程设定原料为 IL 对数生长末期培养液获得大肠杆菌沉淀（2~3 g 湿重）。图 28.3 所示 SD^PAGE 结果为利用该方法纯化的结果。

(1) 可以在冰上部分复融沉淀，并用 20 mLTEN 缓冲液 [50 mmol/LTris-HCl(pH7.9)、0.Immol/LEDTA、100 mmol/LNaCl] 重悬。

(2) 添加溶菌酶至终浓度 250pg/mL, 冰上孵育细胞 20 min。或者使用 1500kU 重组溶菌酶 (EMD/Novagen 公司#H110)。

(3) 冰上超声细胞, 重复 4 次，每次工作 15s，间歇 15s。

(4)15000r/min(27000 g) 离心裂解液 15 min。

(5) 于 23°C 将上清液 (1~2 mL) 上样于免疫亲和柱，收集流穿部分。

(6) 用含 100 mmol/LNaCl 的 TE(约 20 mL) 清洗层析柱，然后再用含 500 mmol/L(原文为 500 mL, 译者认为原文笔误）NaCl 的 TE(约 5 mL) 清洗层析柱。用含 100 mmol/LNaCI 的 TE(约 10 mL) 再平衡。

(7) 用含 0.75mol/LNaCl 和 40% 丙二醇的 TE 洗脱层析柱 (室温）。冰上收集洗脱组分。

(8)SDS-PAGE 电泳分洗脱峰。图 28.3 中 SDS-PAGE 结果显示一步层析产物纯度。合并所需组分（图 28.3 泳道 5、泳道 6)，用合适的储存缓冲液透析 [转录蛋白，用 50 mmol/LTris-HCl(pH7.9),50 mmol/LNaCUO.Immol/LEDTA.O.lmmol/LDTT 和 20%~50% 甘油]。