qPCR的原理
这一期关注点在qPCR的原理上，我会将每一环节拆开掰碎展示给大家。
上期讲过，要对样本中的靶标进行定量，就要将靶标的数量和一定的信号反馈建立联系。这一点比较容易理解，比如我们要对一种荧光物质定量，那么一定范围内荧光信号的强度（吸光度）就与物质的数量成正比；对某种底物定量，那么在酶浓度一定且过量的情况下，一定范围内底物浓度与催化初始速率成正比。对靶标的定量也要从这个方向努力，比如上期介绍过的QuantitativeCompetitive PCR（QC-PCR）就是这样的设计。
qPCR也是要从这里入手，它的出现得益于DNA聚合酶5’核酸外切酶活性的发现[1]和荧光检测设备（CCD）的问世。核酸外切酶活性可以将链延伸的过程中碰到的杂交探针给水解掉，从将荧光分子释放下来发出荧光信号。探针是参与qPCR反应的重要元件[2]，它是一条能与扩增区段杂交的寡核苷酸单链（Fig.1）。其5’端标记了特定的荧光基团Reporter，比如常见的FAM，用于指示荧光信号；3’端标记了特定的荧光淬灭基团Quencher，比如TAMRA，它可以吸收荧光基团发出的光，使其淬灭，这就是荧光共振能量转移（FRET）。因此一条完整的探针理论上是不会发出荧光的，因为荧光基团发出的光都被淬灭基团所吸收，但当探针被水解掉之后，其结构不再完整，淬灭基团就不能吸收荧光了。
Figure 1. 探针法荧光定量的原理示意图
理论上，每扩增一个循环，N个靶标分子产生出2N个新分子，同时会产生N个新的reporter，因此荧光信号就与产物的量成正比。在循环开始之前和结束之后都分别测定reporter和quencher的荧光强度（在整个PCR过程中quencher的荧光强度基本保持一致），RQ+为循环结束后的reporter强度除以quencher的强度，RQ-为循环开始前的reporter强度除以quencher的强度，该循环的荧光强度△RQ=RQ+-RQ-。在反应的初期，参与反应的“原材料”是充足的，PCR是指数扩增，△RQ也是呈指数增加的，但是初始的荧光分子数目太少，荧光需要累积到一定的循环数后才能被CCD检测到，这段时期叫做背景期（Baseline，Fig. 2）。背景期后为指数扩增期，在该时期PCR反应一直维持指数扩增，直到原材料接近耗尽后，才开始逐渐进入平台期，荧光信号不再变强。对于qPCR来讲，指数扩增期才有意义。
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综述
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