耐红霉素葡萄球菌中克林霉素诱导型耐药株的检测分析
目前,葡萄球菌是引起院内和社区感染,甚至全身感染的常见病原菌。特别是耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）比例上升，使葡萄球菌对各种抗生素产生多重耐药。MRS可同时对β-内酰胺类、酶抑制剂复合抗生素及碳青霉烯类抗生素耐药。因此，临床医生在治疗由MRS引起的感染者时，转而考虑使用大环内酯类（如红霉素）、林可酰胺类（如克林霉素）和β(族) 链阳霉素（如奎奴普丁,即MLSB 类抗生素）。但有研究发现, MRS可同时对MLSB 类抗生素耐药,而且红霉素具有诱导克林霉素耐药的作用。常规药敏试验不能检测可诱导克林霉素耐药的情况。用K-B纸片琼脂扩散法的D -试验检测可诱导克林霉素耐药情况，了解检出的葡萄球菌中可诱导克林霉素耐药株的发生率，以指导临床医生正确合理使用抗生素。
1 材料和方法
1.1 菌株
试验菌株为我科从本院临床送检各种标本分离的葡萄球菌240株。所有菌株均经Vitek-32全自动分析仪鉴定。其中金黄色葡萄球菌74株,凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)166株。用金黄色葡萄ATCC25923作为药敏试验的菌株。
1.2 主要试剂和
红霉素纸片（15μg）和克林霉素纸片（2μg）均购自英国Oxoid公司。培养基为杭州天和试剂有限公司提供的M-H琼脂干粉，配制成4mm厚的平板供用。GPI鉴定卡和GPS-110药敏卡为生物梅里埃公司产品。Vitek-32全自动细菌分析仪。
1.3 药敏试验 使用标准的纸片琼脂扩散（K-B）法检测葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药性。
1.4 D-试验
采用CLSI/NCCLS推荐的方法［1］按照以上琼脂扩散法将浓度为0.5麦氏单位待测菌液均匀涂布于M-H平皿上，在两种药敏纸片边缘间隔为15～26mm的距离分别贴上红霉素和克林霉素纸片，置于35℃恒温孵育箱孵育24h判读结果。若邻近红霉素一侧的克林霉素抑菌环出现“载平”现象(称为“D”抑菌环)，即克林霉素纸片的抑菌环看似一大写的D时，提示存在可诱导的克林霉素耐药,即D-试验阳性;若不出现“载平”现象，判为D-试验阴性。
2 结果
2.1; 240株葡萄球菌对红霉素（EM）和克林霉素（CM）的不同耐药表型分布
EM -S和CM -S者为41.67%(100/240), EM -R和CM-R者为22.08%(53/240), EM -R和CM-S者为36.25%(87/240)。见表1。表1 240株葡萄球菌对红霉素和克林霉素耐药表型分布（略）注：MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MSSA对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；MRCNS：耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌；MSCNS：对甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌；S-敏感，R-耐药。表内数字为菌株数。
2.2 D-试验阳性(红霉素诱导克林霉素耐药) 的发生率
对红霉素和克林霉素均敏感的100株葡萄球D-试验均为阴性;对红霉素耐药而克林霉素敏感的87株葡萄球中,D-试验阳性46株,即红霉素诱导克林霉素耐药的发生率为52.87%（见表2）D-试验阳性株占全部葡萄球菌的19.16%（46/240）。表2
红霉素诱导克林霉素耐药的发生率（略）
3 讨论
葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药表现为持续型耐药和可诱导性耐药两种。持续型耐药是对红霉素和克林霉素均耐药，可用一般的药敏试验方法检测，而可诱导性耐药是对红霉素耐药而克林霉素敏感的菌株，用一般的药敏试验（如肉汤稀释法、仪器法等）都检测不出来。D-试验被用于检测红霉素对克林霉素诱导耐药性,该方法简便易行,按常规“K-B”法药敏试验操作，只是将红霉素和克林霉素纸片按一定距离（如15～26mm）放置,即可观察诱导耐药结果。我们采用18mm的纸片距离进行试验
本试验结果显示，对红霉素和克林霉素同时耐药者占所检测葡萄球菌的22.08%,而在MRSA 和MRCNS 中占比率较高,分别占61.53%(24/39)和37.03%(20/54) 。在对红霉素耐药而克林霉素敏感的金黄色葡萄球菌和CNS中D-试验阳性者分别占64.28%（18/28）和47.45%（28/59）,即克林霉素诱导型耐药株的发生率分别为64.28%和47.45%。46株D-试验阳性菌株占所检测葡萄球菌的19.16%(46/240),占对红霉素耐药而克林霉素敏感菌株(87株) 的52.87%。
在对红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌中,克林霉素诱导型耐药株的检出率在不同国家、地区和医院存在一定差异。Fiebelkorn 等报道［1］,对红霉素耐药的金黄色葡萄球菌和CNS中,克林霉素诱导型耐药株检出率分别为29.0%和30.5%；而国内沈定霞等报道［2］，金黄色葡萄球菌的67.3%有可诱导耐药性,CNS有45.3%的耐药诱导发生率；在本结果中,可诱导耐药的发生率在金黄色葡萄球菌中是64.28%,在CNS中是47.45%。这些结果表明，克林霉素诱导型耐药发生率己达相当高的程度。因此，对于临床分离的对红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌作药敏测试时，应同时作D-试验检测克林霉素诱导型耐药株，以为临床医生正确选用药物和制定治疗方案提供依据。
根据NCCLS规定, 在实验室进行D-试验时，若D-试验结果阳性，即克林霉素诱导耐药阳性，应报告为克林霉素耐药株，而不报MIC值。此时报告中可加入如下评论: “由于克林霉素诱导耐药试验阳性,推测此菌株对克林霉素耐药,但在少数患者治疗中克林霉素可能仍有效”。及时、准确的抗生素药敏试验结果可作为临床医生合理用药的依据,而克林霉素常规的体外药敏试验可能会造成假的敏感率,只有通过红霉素和克林霉素双纸片法的D-试验才能检测出诱导型克林霉素耐药株,保证对克林霉素耐药性检出的准确性,以指导临床医生更合理使用抗生素。
