食用合成色素的测定——薄层层析法
1、原理
聚酰胺是具有二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离，然后再在碱性条件下解吸色素，再在薄层层析法进行分离鉴别，与标准比较定性、定量（纸层析进行定性，薄层层析进行定量）。
2、操作步骤
食品其形态是千变万化的，添加在食品中的色素方式亦是各种各样的，有的拼色加入，有的加在食品的表层几个色素点，有的覆盖一层色素, 有的用色素和鸡蛋，很形象地作成传说中的故事、动物、花卉以及象征丰收、延年益寿、节日愉快、生日快乐等附在食品的最显眼的地方，属于这类食品的有中式糕点、西式糕点，还有饮料、小食品等色素的测定。样品不同，处理方法则就不一样。
⑴ 样品表面色素的测定
如中式、西式、生日蛋糕、节日寿糕一类，首先将代表性的样品整体称重，记录重量，然后分别取下相同着色部分，进行提取和分离，不要将部分着色样品和整个或大部分不着色样品混在一起。如果这样，分离就困难，而且增加分离误差，使结果偏差大，例如一块蛋糕重500g，取下色素部分经测定是50mg，表示500g重的含量即万分之一。
⑵ 样品外皮色素的测定
如儿童食品中的糖豆、朱古力豆、红心果等样品，只需将外表皮色素用少量的水溶下来（在用水溶解之前，先称重量并记录），并定容一定体积（将没有色素的样品弃去），供检验用，其计算与上面一样。
⑶ 非酒精性饮料中色素的测定（各种汽水、桔子汁等）
(1) 吸附
吸50ml样→与烧杯中→在电炉上加热至沸→不断搅拌除CO2→加1g聚酰胺粉（60℃活化1小时）→充分搅拌→使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗过滤→用80℃热水20ml洗沉淀物→用甲醇-甲酸（6︰4）20ml再洗沉淀物（除天然色素）→直到滤下来溶液无色→再用80℃热水150ml分次洗沉淀物。
(2) 解吸
在不抽滤条件下，将9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脱下来，收集于蒸发器中，水浴中浓液到5ml左右，加3滴20%柠檬酸溶液（使色素稳定），定容10ml，供薄层点样用。
(3) 注意事项
样品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的柠檬酸调节pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中对色素吸附力强，吸附亦完全）。
如果样品不含天然色素，除CO2后直接加聚酰胺吸附。
⑷ 对各种糖果色素的测定
1) 样品处理
a. 硬糖（不含蛋白质、淀粉）粉碎→称样3g→加50ml水溶解→再加30%柠檬酸3滴调pH=4
b. 软糖（含淀粉高果饴）除外层冰糖屑→切碎→加50ml热水溶解→用20%柠檬酸调pH=4→加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分钟→溶液中出现沉淀物直到变清
c. 奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H2SO4调pH→加1%钨酸钠使蛋白质沉淀，奶脂凝集沉淀→布氏漏斗抽滤
2) 吸附色素
1g聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→搅拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽滤→用80℃水洗漏斗上的沉淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到pH与原水相同
3) 解吸色素
沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸发皿中→水浴浓液到4ml→加20%柠檬酸3滴→用水定容10ml→留做点样用（单一色素直接比色，拼色要分离，先定性后定量）
⑸ 肉和肉制品中色素的测定
1) 前处理
称处理样→加海砂3g和20ml丙酮→于研钵中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮
2) 解吸样液中的色素
将上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液从肉蛋白中使色素全部解吸下来→加热到70℃→用1︰10H2SO4调PH再加1ml10%钨酸钠→使蛋白质全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽滤→用70℃水20ml洗漏斗→收集全部滤液
3) 吸附样液中的色素
称1g聚酰胺粉+上面的滤液→搅拌→抽滤→用水洗漏斗中沉淀物→直到滤水与原水PH相同
4) 解吸样液中色素（与非酒精性饮料相同）
⑹ 果脯类色素的测定
1) 处理
取样研碎后称2g→加50ml水→加热70℃使溶解
2) 吸附
吸附剂1g+上述液→抽滤→用70℃热水洗沉淀物
3) 除天然色素
用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到滤液无色为止→再加甲醇10ml进一步除天然色素→70℃热水洗，不断搅拌
4) 解吸
用解吸液解吸样品沉淀物中全部人工合成色素→浓液解吸液（甲醇、氨）直到无甲醇、氨时→用1︰10H2SO4调pH=4→再按上述加吸附剂操作重复1-2次，把天然色素全部去净为止，最后解吸、定容同上。
⑺ 各种加工蔬菜中色素的测定
这一类色素测定按理论应该以蜜饯的操作来处理，但在实验中这些样品胶体过多，使解吸、过滤等操作非常困难，所以我们应该按下述方法进行：取样20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇溶液，浸泡2小时，再以含有1%氨水的70%乙醇反复浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脱下来，置70-80℃水浴上，将全部浸出液浓缩，待氨全部逸出去（没有氨味），调pH=4，加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗过滤，以200ml 70-80℃水洗涤漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗脱天然色素。以上操作同蜜饯中色素的测定方法。
⑻ 提纯色素溶液的纸层析定性
为了判断样品中存在有几种色素以及是什么色素，必须进行纸层析进行鉴定。
经浓缩后样品色素溶液→于新华中速层析滤纸上点样→点样量3-5微升（若样品含量低可取出1ml在浓缩至0.2ml再点样）→点样点的直径应不超过2毫米为宜→点样线距底边2厘米→样点间距离以及左右纸边各距2厘米→用展开剂展开→测量各色素点的Rf值→于标准色素Rf值对照→确定何种色素（以标准色素斑点Rf值衡量样品各色素斑点的Rf值是否于标准点在同一条直线上，色素的颜色是否完全一致，就可确定样品色素属于何种色素）。
Rf（比移值）=斑点移动距离/溶剂前沿距离
所使用的展开剂有：
1)正丁醇︰无水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3
2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4
3)异丁醇︰无水乙醇︰水 = 3︰2︰2
⑼ 提纯色素溶液的薄层分离和定量
经过纸层析定性之后，含有一种色素的样液定容之后，离心即可定量；含有两种以上的复合色素的样品溶液，需要经过薄层分离为单色素后，再用比色法分别定量，测定出各种色素的含量。
具体步骤是：薄层板制板→点样层析→比色→标准曲线绘制→计算含量
1) 薄层板制备
聚酰胺粉1g于研钵中→加15ml 75%甲酸→搅拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅胶G→研磨1分钟→立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗净，干燥后用酒精擦拭干净，涂板时可用涂本器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三块（厚度为0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→盖好盖子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小时→取出玻璃板→于空气中风干→于60-65℃烘箱30分钟→放入干燥器中备用
2) 点样层析
用点样管（毛细管、微量注射器）将浓缩并定容的样液点在薄层板上→基线距底边2厘米→点成与底边平行的条状→两端距边各为2厘米，点样量一般为0.4ml→点样时要用电吹风机边点边吹干→然后进行展层析
展层缸先用溶剂系流30分钟→再把点好样的薄层板放入展析缸用上行法展开→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大约1小时看色素已明显分开后→即可取出薄板→晾干
对溶剂系流的选择是：a) 分离胭脂红、苋菜红、新红、柠檬黄、桔黄、靛蓝等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4（这种展开剂主要分离靛蓝，因为靛蓝上升很快，其它上升很慢）；b) 分离柠檬黄、胭脂红、苋菜红、柠檬黄、桔黄等时用展开剂为2.5%柠檬酸钠︰氨水=4︰3（柠檬黄上升很快，其它上升慢）；c) 对于分离两种红色素（苋菜红、胭脂红）的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4（主要是苋菜红与胭脂红上升快，其它色素上升慢）。
3) 比色定量
将薄层板展开后→用小刀分别将各条色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽滤→于水浴上蒸发到无氨味→定容10ml→分别测出消光值E（根据各种色素的最大吸收波长测定其光密度）→从标准曲线上查出相应的各色素含量.
4) 标准曲线的制备
先配成标准色素贮备液（100微克/ml），称0.1g标准色素加水稀释至1000ml
10ml比色管 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
标准应用液 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
加水 分别加水至10ml
相当于μg/ml 0 1 5 10 20 30 40 50 60 70
分别测出EO-E9的消光值以水为参比，以色素浓度为横生标，消光值为纵坐标，绘制标准曲线。以水为参比，pH值为6，各色素的最大吸收波长为下：
胭脂红 508纳米；柠檬黄 428纳米；苋菜红 520纳米；
晚霞黄 485纳米；赤藓红 528纳米；靛蓝 610纳米；
