分光光度法 朗伯--比尔定律
一、分光光度法（spectrophotometry）
分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，此技术灵敏、精确、快速和简便，为生物化学研究中广泛使用的方法。
（一）分光光度法的基本原理
基本原理是朗伯-比尔定律（Lambert-Beer’sLaw），又称吸收定律，即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度（absorbance，A）与吸光物质的浓度（consenreation，C）及吸收层厚度（length，L）成正比, 用公式表示为
A = ε C L
其中A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，C为吸光物质浓度，L为吸光溶液的厚度。
光波是指波长在0.3~3 μm之间的电磁波（图1-1），颜色跟波长和频率有关，分为可见光和不可见光（表1-1）。可见光指能引起视觉的电磁波，波长在400-700 nm，其中紫光频率最大，波长最短，红光恰好相反。不可见光主要包括红外线、紫外线、伦琴射线。发射光的物体叫做光源，光源分为自然光和人造光。按照发光原理分为辐射发光、电子发光、化学发光、生物发光等。
（二）分光光度法的应用
1．定量分析 待测样品浓度的测定在实际工作中，由于盛放溶液的比色杯厚度是一致的，待测物质的浓度可通过以下几种方法测得：
（1）标准比较法（standard comparative method）：在相同条件下，配制标准溶液和待测样品溶液，测定它们的吸光度。比较两者的吸光度，即可求出待测样品溶液的浓度。
（2）标准曲线法（standard curve method）：配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出其吸光度。以各标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，在方格坐标纸上绘出标准曲线。在相同条件下测出待测样品的吸光度后，从标准曲线上可以直接查出其浓度。此法通常适用于大批样品的分析。
（3）标准系数法（standard coefficient method）：多次测定标准液的吸光度后，按下式求出标准系数。
标准系数 = 标准液浓度/标准液平均吸光度
也可从标准曲线上求出标准系数，再用同样方法测定待测溶液的吸光度，并代入下式求出待测物质的浓度。
C待测= A待测×标准系数
（4）回归分析法（regression analysis）：将制作标准曲线的各种标准液浓度，与其相应的吸光度，用回归分析法求出一个回归方程式。以后，只要测定条件不变，将样品液吸光度值代入该方程式，则可算出样品液的浓度。
2．定性分析将各种不同波长的单色光分别通过一定浓度物质的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，此曲线称为吸收光谱曲线。各种物质都有它自己一定的吸收光谱曲线，因此应用吸收光谱曲线可对有机化合物、生物物质和药物等进行某些特性或结构分析。当将一种未知物质和已知物质的吸收光谱曲线比较时，若二者相同，可推断它们是同一种物质，从而对该物质作出鉴定。
3．物质纯度分析：分光光度法也可用来测定物质的相对纯度。例如DNA纯品的A260/A280为1.8，若比值高，说明含有RNA；比值低说明有蛋白质存在。RNA纯品的A260/A280为2.0，比值低于1.7时，说明有蛋白质污染。
（三）分光光度法的误差
1．溶液浓度待测物质溶液的浓度过高或过低都会偏离郎伯-比尔定律，影响检测的准确度。一般情况下，待测物质溶液浓度的吸光度在0.1~0.8之间最符合光吸收定律，此时检测线性好，读数误差小。如吸光度不在此范围，可适当稀释或浓缩比色溶液再进行测定。
2．干扰物质某些物质能干扰待测物质显色反应过程，或其本身具有与待测物质相同或相似的光吸收特性。这些物质存在于待测溶液中时，会使溶液测定值与待测物质实际浓度不相符合，因而产生误差。
3．反应条件溶液pH、环境温度和显色时间等反应条件的改变，都会引起待测物质的结构或成份发生变化，从而使溶液颜色的深浅度发生改变，进而产生误差。
4．反射光与散射光待测溶液与参比溶液的光折射率不同时，会引起发射损失的不同。待测溶液浑浊，入射光通过时会产生散射效应。这些非吸收作用都会产生测量误差。
5．狭缝宽度分光光度计单色器分出来的单色光是通过狭缝截获的，如果狭缝的质量不好或开得过大，所截获的单色光的单一性差，杂波会与测定光波一起通过待测溶液，干扰测定，产生误差。
6．仪器噪声分光光度计的噪声主要由光源强度、电子器件和光电管所产生的。仪器噪声过大，可严重影响测定的灵敏度和准确度。
7．吸收池吸收池的不匹配、透光面不平行或定位不准确等，都会使其透光率产生差异，使测定结果产生误差。
