甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞
生物按照从脱氧核糖核酸 (DNA)转录得到的信使核糖核酸(mRNA)上的遗传信息合成蛋白质的过程。由于mRNA上的遗传信息是以密码(见遗传密码)形式存在的,只有合成为蛋白质才能表达出生物性状,因此将蛋白质生物合成比拟为转译或翻译。
实验材料 | 蛋白质 |
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试剂、试剂盒 | 甲硫氨酸PBS |
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仪器、耗材 | 培养箱离心管 |
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实验步骤 | 1. 培养悬浮细胞至对数增长期,室温300 g 离心5 min。回收107~108细胞。 2. 每2×107细胞用约10 ml 37℃的短时间标记培养基在圆锥型试管中洗涤,于室温300 g 离心5 min 回收细胞,小心重悬细胞并重复洗涤过程。
3. 以37℃的短时间标记培养基重悬至5×106细胞/ml,于37℃保温15 min 以耗尽细胞内的甲硫氮酸,间歇摇动。
4. 室温解冻[35S]甲硫氨酸,并用37℃短时间标记培养基来配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。 5. 室温300 g 离心5 min,回收细胞,每2×107细胞以4 ml[35S]工作液重悬于圆锥试管。37℃水浴保温30 min~3 h,频繁翻覆试管以混悬细胞。
6. 4℃ 300 g 离心回收细胞,小心重悬于10 min 冰冷PBS缓冲液,重复离心操作。
7. 必要时,用TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量,按免疫亲和层析、免疫沉淀法和单向和双向凝胶电泳处理和分析细胞。 展开 |
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注意事项 | 1. 在标记过程,会释放挥发性的[35S]化合物,在使用前须把过于37℃水浴的[35S]甲硫氨酸紧紧密封,不要在37℃放置超过30 min。
2. 培养液和冼涤液具放射性,须遵循放射性物质的使用和丢弃的安全守则进行。
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