RNA在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检...

RNA在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测实验

实验方法原理

实验材料 小鼠或鸡的胚胎或器官

试剂、试剂盒 PBS 冰预冷PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20 4℃及室温4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS (4% PFA) 4℃PBT中溶25%、50%、75%的甲醇（甲醇 PBT)100%甲醇PBT中溶6% (V V)过氧化氢（H2O2; Aldrich)(可选）

仪器、耗材 解剖工具（如剪刀和镊子）70%乙醇浸泡解剖显微镜20 ml咬合盖（snap-cap)玻璃小瓶小勺或者刮铲用来放置2 ml小离心管的带有适配器的加热板旋转平台（Rocker platform)

实验步骤

1) 如果有必要的话，在冰冷的PBS溶液中，使用合适的解剖器具在解剖镜下将小鼠或鸡的胚胎切成小块。完全除去胚胎外膜和胞衣。打开腔。

2) 将样本转移到装有10 ml左右冷的4%多聚甲醛的20 ml咬合盖玻璃小瓶中。4℃固 定4 h到过夜。

3) 4℃下用PBT洗样本两次。即使样本不做存储立即使用，也建议进行脱水、水化和漂白步骤（步骤4〜8)，这些步骤可以改进组织的浸透性并且增加方法的灵敏度。也可以选择胚胎直接从步骤8开始操作。

4) 室温下分别用25%、50%和75%的甲醇/PBT洗样本，最后用100%甲醇再洗2次 以达到脱水的目的。

5) 室温下使用甲醇/PBT溶液以相反的步骤洗样本，最后再用PBT洗2次以水化样本。

6) 可选步骤：用含有6%双氧水的PBT溶液室温下漂白样本15 min。

7) PBT溶液洗样本3次。

8) 用溶于PBT中10μg/ml的蛋白酶K室温下消化样本15 min。

9) 用新鲜配置溶于PBT中的2 mg/ml甘氨酸洗样本以终止消化。

10) PBT洗样本2次。

11) 新鲜配制的0.2%戊二醛/4%多聚甲醛/PBT再在室温下固定样本20 min。

12) PBT 洗 3 次。

13) 向玻璃小瓶中加1 ml预热的预杂交溶液A，然后转移样本到2 ml离心管中。

14) 移除溶液然后加2 ml新鲜配置并预热的预杂交溶液A。盖上盖子，放在65℃加热 板上并确保盖子不暴开。将加热器的侧面连在旋转平台上。65℃预杂交样本3h。 不管是在步骤14以前还是以后，样本都可以在预杂交溶液中-20℃保存6个月。

15) 移除预杂交溶液，加入1 ml含有1μg /ml地高辛标记核酸探针的杂交溶液A，70℃杂交过夜

对于3个10. 5天的小鼠胚胎、2个11. 5天小鼠胚胎或者5个17期的鸡胚胎来说，1 ml的杂交溶液就足够了。

16) 接下来用酶探测RNA杂交物

收起 

注意事项

其他

其他试剂：

PBT中溶10μg/ml蛋白酶K，没有预先消化的 PBT中溶2 mg/ml甘氨酸（Merck) 新鲜配置，PBT中溶4% (m/V)高聚甲醛和0.2% (V/V)戊二醛（EM级，Sigma) 新鲜配制预杂交溶液A，杂交溶液A:在预杂交溶液A中加入终浓度1μg/ml的地高辛标记的核酸探针