翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验（三）

2.2 糖基化

糖 基 化 是 一 种 常 见 的 P T M , 并 且 已 经 证 明 能 够 影 响 酶 的 活 性 、蛋 白 质 定 位 、稳 定 性 、信 号 转 导 、细 胞 黏 附 和 蛋 白 质 相 互 作 用 (Spiro, 2002k 目 前 已 经 发 现 在 肿 瘤 恶 性 转 化 和肿 瘤 发 生 时 ，生 物 体 液 中 蛋 白 质 和 细 胞 表 面 的 糖 基 化 模 式 会 发 生 变 化 (Durand and Seta,2000)。一 个 蛋 白 质 组 中 存 在 着 大 量 糖 基 化 修 饰 。O- 糖 基 化 蛋 白 质 是 在 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸位 点 发 生 修 饰 , 而 C -糖 基 化 则 靶 向 于 色 氨 酸 ,N-糖 基 化 靶 向 天 冬 酰 胺 。发 生 N -糖 基 化 的蛋 白 质 会 有 一 些 共 同 之 处 ，如 核 心 结 构 、一 些 去 除 N 联 结 构 的 酶 ，并 且 普 遍 分 布 在 细 胞 膜胞 外 区域（Medzihradszky, 2005 ) 。 N-糖 基 化 位 点 有 一 个 确 定 的 共 有 序 列（consensussequence) ,即N-X-S/T ,X 是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(Pless and Lennarz, 1977)。另— 个 靶 向 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 残 基 的 修 饰 是 O联β-N-乙 酰 葡 糖 胺 (O G k N A c ) 。 Gerald Hart和 同 事 开 创 了 这 种 动 态 核 质（nucleocytoplasmic) P T M 研 究 的 先 河（Holt and Hart,1986)。发 生 这 种 修 饰 的 许 多 靶 向 蛋 白 质 也 能 够 发 生 磷 酸 化 修 饰 ，推 测 这 种 修 饰 对 蛋 白质 磷 酸 化 修 饰 会 有 拮 抗 作 用 ( A h m a d et aL , 2006)。

质 谱 鉴 定 磷 酸 化 的 一 些 问 题 同 样 也 出 现 在 糖 基 化 研 究 中 。相 对 未 被 修 饰 的 蛋 白 质 ，这 些 修 饰 在 丰 度 上 都 倾 向 于 亚 化 学 计 量 。蛋 白 质 糖 基 化 和 O G l c N A c 修 饰 在 质 谱 中 都 是不 稳 定 的 ，通 常 产 生 低 质 量 的 测 序 谱 图 。尽 管 N -糖 基 化 的 一 种 共 有 序 列 已 经 非 常 明 确 ，然 而 在 体 内 仅 有 部 分 含 有 这 一 共 有 序 列 的 蛋 白 质 发 生 了 糖 基 化 。

上 面 提 到 的 可 应 用 于 磷 酸 化 分 析 的 替 代 的 肽 段 断 裂 方 法 同 样 适 用 于 糖 基 化 。能够解决 糖 基 化 低 丰 度 问 题 的 富 集 技 术 也 已 存 在 (Mechref e t a L ，2008)。使 用 凝 集 素 亲 和 层 析(lectin affinity chromatography) 可 选 择 性 地 富 集 糖 蛋 白 。凝 集 素 是 一 种 高 度 特 异 的 糖 结合 蛋 白 ，并 能 够 与 固 相 基 质 偶 联 . 偶 联 好 的 树 脂 与 复 杂 的 水 解 蛋 白 质 混 合 物 混 合 ，通 过 洗涤 、洗 脱 即 可 分 离 到 适 用 于 蛋 白 质 组 学 分 析 的 糖 肽 组 分 。 O G l c N A c 可 用 P-消 除 法 及 后续 的 Michael加 成 二 硫 苏 糖 醇 或 生 物 素 -戊 胺 (biotin pentylamine)反 应 来 富 集 ，这 种 方 法类 似 于 前 文 磷 酸 化 中 所 详 述 的 内 容 (Wells et al. ，2002)。另 一 种 方 法 是 N -联 糖 肽 固 相提 取 法（solid-phase extraction of N-Iinked glycopeptides，S P E G ), 这 种 方 法 使 用 肼 化 学法 (hydrazine chemistry)直 接 将 糖 肽 添 加 到 固 相 支 架 上 (Tian et al. ，2007)。洗 漆 后 ，用肽 -N -糖 苷 酶 (peptide-iV-glycosidase)处 理 来 洗 脱 糖 肽 。凝 集 素 亲 和 层 析 色 谱 法 的 优 点 在于 ，能 够 结 合 的 糖 蛋 白 范 围 非 常 广 , 通 过 不 同 糖 苷 酶 洗 脱 能 够 有 效 分 离 不 同 类 型 的 糖 肽(Yang and H a n c o c k , 2005)。也 有 专 门 的 柱 子 ，所包含 的 凝 集 素 特 异 地 结 合 一 定 类 型 的糖 连 接 结 构 ，能 提 供 更 高 不 同 程 度 的 选 择 性 富 集（Tian et al. , 2007)。需 要 说 明 的 是 , 使用 糖 苷 酶 诜 脱 糖 肽 是 从 肽 段 上 切 下 寡 糖 ，这 使 得 原 本 可 以 通 过 质 谱 获 得 的 结 构 信 息 丢 失 。但 是 这 却 大 大 简 化 了 数 据 分 析 过 程 , 因 为 糖 基 化 的 天 然 结 构 非 常 复 杂 ，并 且 以 多 变 的 聚 糖基 化 (polyglycosylated)形 式 存 在 。

2.3 泛素化和苏素化修饰

泛 素 是 一 个 由 7 6 个 氨 基 酸 组 成 的 蛋 白 质 ，能 够 通 过 其 C 端 的 甘 氨 酸 残 基 结 合 于 底物 赖 氨 酸 的 α氨 基 基 团 。这 个 过 程 需 要 E 1 、E 2 、E 3 酶 共 同 参 与（Fang and W e i s s m a n ,2004)。泛 素 的 序 列 含 有 7 个 赖 氨 酸 , 这 7 个 赖 氨 酸 能 够 被 泛 素 化 选 择 ，从 而 形 成 泛 素 链(Fang and W e i s s m a n ，2004)。被 进 一 步 泛 素 化 的 泛 素 分 子 内 部 的 赖 氨 酸 能 够 决 定 泛 素化 修 饰 的 生 物 学 意 义 。例 如 ，K 4 8 连 接 的 泛 素 链 能 引 导 被 修 饰 蛋 白 质 经 由 26S 蛋 白 酶 体降 解 , 而 K 6 3 的 连 接 形 式 则 参 与 到 D N A 损 伤 反 应 、蛋 白 质 运 输 、N F -KB 信 号 通 路 的 信 号转 导 等 过 程 (Ikeda and Dikic，2008; Pickart and F u s h m a n ，2004)。泛 素 化 蛋 白 的 周 转 非常 迅 速 ，这 导 致 这 种 P T M 处 于 低 稳 态 水 平 (Peng etal. ，2003)。而 使 泛 素 化 位 点 的 预 测更 加 复 杂 化 的 是 , 几 乎 没 有 数 据 能 够 证 明 泛 素 化 存 在 一 个 通 用 基 序 (SUter etal. , 2008)。

另 一 个 类 似 泛 素 的 小 蛋 白 质 分 子 就 是 苏 素 化 修 饰 蛋 白（S U M O ) 。尽 管 两 种 蛋 白 质一 致 性 仅 1 8 % , 但 是 它 们 的 三 维 结 构 却 有 相 似 性 (Bayer et al. ，1998)。苏 素 化 修 饰 和 泛素 化 共 享 相 同 的 E 1 、E 2 、E 3 酶 , 将 S U M O 分 子 结 合 到 一 个 保 守 基 序 内 部 的 氨 基 酸 残 基上 。苏 素 化 修 饰 优 先 发 生 在 女 K -X -E 序 列 中 ，^ 代 表 一 个 疏 水 性 氨 基 酸（Rodriguez etal. ，2001)。苏 素 化 修 饰 靶 向 于 大 量 参 与 各 种 不 同 细 胞 进 程 的 蛋 白 质 , 如 转 录 调 节 、核 小体 形 成 、细 胞 核 孔 复 合 物 和 D N A 修 复 (Melchior et a L ，2003)。苏 素 化 修 饰 能 够 与 泛 素化 竞 争 ，从 而 阻 止 蛋 白 质 被 降 解 , 稳 定 细 胞 所 需 的 关 键 的 酶 。这 种 修 饰 还 能 够 将 蛋 白 质 进行 特 定 的 细 胞 定 位 , 如 核 孔 复 合 体 (M anza et al. ，2004)。

目 前 已 经 发 展 了 一 些 有 效 的 富 集 方 法 来 分 离 泛 素 化 和 其 他 苏 素 化 修 饰 的 蛋 白 质 。其中 最 成 功 的 一 种 是 在 泛 素 及 类 泛 素 分 子 的 基 因 序 列 中 整 合 人 氨 基 末 端 表 位 标 签（aminoterminal epitope t a g K P e n g et al. ， 2003; Tagwerker et al. ， 2006)。 目 前 已 成 功 使 用 了多 组 氨 酸 标 签 ，以 及 由 多 组 氨 酸 标 签 和 F L A G 标 签 组 成 的 串 联 亲 和 标 签 (C h a n g , 2006)。串 联 亲 和 标 签 纯 化 方 法 能 够 减 少 假 阳 性 的 出 现 率 ，但 是 无 法 完 全 消 除 。使 用 抗 泛 素 类 分子 的 抗 体 是 一 种 选 择 , 但 是 这 种 抗 体 应 用 于 免 疫 沉 淀 中 以 分 离 泛 素 蛋 白 质 的 方 法 仍 在 发展 中 。也 可 利 用 泛 素 结 合 蛋 白 质 以 避 免 一 些 由 抗 体 和 亲 和 标 签 引 起 的 问 题 (Kirkpatricketal. ，2005)。表 位 标 签 在 简 单 模 式 系 统 ，如 酿 酒 酵 母 (Sacc/iarom^ ycescereTO’ h a e ) 中应用非 常 方 便 ，因 为 编 码 未 标 签 泛 素 的 多 个 基 因 可 被 删 除 ，使 得 细 胞 中 仅 有 含 表 位 标 签 的 泛 素分 子 。

事 实 上 ，泛 素 化 和 苏 素 化 修 饰 都 是 蛋 白 质 类 P T M , 可 采 用 多 种 质 谱 的 手 段 鉴 定 靶 蛋白 。当 胰 酶 消 化 泛 素 化 蛋 白 质 时 ，部 分 泛 素 分 子 被 切 割 下 来 。剩下胰 蛋 白 酶 消 化 片 段 的泛 素 化 位 点 上 含 有 2 个 甘 氨 酸 残 基 ，通 过 一 个 异 肽 键 与 赖 氨 酸 相 连（P eng et a L ，2003)。这 一 肽 段 导 致 在 赖 氨 酸 残 基 处 产 生 了 一 个 114 D a 的 标 称 质 量 漂 移 ，而 且 由 于 胰 蛋 白 酶 不能 识 别 修 饰 过 的 赖 氨 酸 ，因 而 还 丢 失 了 一 个 胰 蛋 白 酶 酶 切 位 点 。对 于 其 他 苏 素 化 修 饰 也有 各 自 特 征 性 的 质 量 漂 移 , 见 表 40. 2(D enis〇n et al. ， 2005)。当 搜 索 谱 图 寻 找 该 类 型 的潜 在 P T M 时 ，可 以 考 虑 这 些 特 性 。

使 用 基 于 质 谱 的 蛋 白 质 组 学 方 法 研 究 此 类 P T M 的 一 个 显 而 易 见 的 问 题 就 是 质 量 S移 (mass shift) 的 冗 余 ，如 表 40. 2 所 示 。从 一 个 肽 的 鉴 定 谱 图 中 可 能 无 法 分 辨 这 是 泛 素化 修 饰 还 是 苏 素 化 修 饰 ，因 为 这 两 种 类 型 都 能 在 赖 氨 酸 残 基 处 增 加 114 D a 。苏 素 化 修 饰会 使 肽 段 质 量 增 加 较 大 ，这 会 影 响 肽 段 的 电 离 ，减 弱 电 离 效 率 。发 生 苏 素 化 修 饰 肽 段 会 使结 果 谱 图 变 复 杂 ，甚 至 无 法 解 读 。 一 个 实 验 室 发 展 了 苏 素 化 修 饰 模 式 识 别 软 件（S U M -m 〇n ) ，来 寻 找 由 复 杂 P T M 产 生 的 碎 片 离 子 模 式 ，并 鉴 定 修 饰 肽 段 及 其 相 应 的 修 饰 位 点