水稻叶片和根蛋白质的纳升级二维液相色谱串联质谱实验

实验材料 反相装填材料

试剂、试剂盒 缓冲液HPLC 级乙腈HPLC 级甲醇氯化钙溶液碳酸氢铵溶液

仪器、耗材 离子讲串联质谱仪

实验步骤

3.1 叶片和根组织的取材以及蛋白质沉淀

( 1 ) 从植物的中部切取未衰老的绿色叶片，立即放入自封塑料袋中冷冻。如果没有冷冻设备，可先放在冰上，然后再放到 -20°C 保存。

( 2 ) 挖出植物根系，在绿色茎段以下一英寸的地方取材。抖动根系，并快速的依次放入 3 个大烧杯中洗去土壤，然后再放入自封塑料袋中冷冻，或暂时保存在冰上。

( 3 ) 称取 2.5 g 去除了茎秆和其他物质的冰冻叶片和根系，用预冷的剪刀剪碎样品后 ，放入预冷的陶瓷研钵中，加液氮研磨至粉末，需要多次添加液氮，以保持组织的冰冻状态。

( 4 ) 把冰冻的叶片或根系粉末放入 40 ml 离心管中，加入 25 ml 叶片重悬液，振荡混合，确保所有的粉末被重悬起来后，在 -20°C 下静置 45 min，再振荡摇匀，35000 g 离心 15 min。

( 5 ) 用玻璃移液管吸去上清液，注意不要扰动沉淀。用等体积的 EDTA 洗液洗涤沉淀。振荡打散沉淀，冰上静置 5 min，35000 g 离心 15 min。重复操作至少两次，直到叶片蛋白质沉淀不再有绿色。

( 6 ) 冰冻干燥沉淀物，得到含有蛋白质、细胞壁和纤维的淡褐色材料。

3.2 从三氯乙酸/丙酮沉淀的粉末中制备蛋白质样品

( 1 ) 针对每个样品，分别称取 20 mg 的三氯乙酸/丙酮沉淀粉末（制备方法见 21.3.1 ) 放入有盖的 1.5 ml 离心管中。

( 2 ) 在每只管中加入 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl  ( pH 8.5 ) ，涡旋振荡 1 min，18000 g 离心 10 min，弃上清液（见注释 1)。

( 3 ) 在每只管中加入 500 μl 的 8 mol/L 尿素，涡旋振荡 5 min，超声波水浴处理 10 min，然后旋转振荡 30 min。

( 4 ) 18000 g 离心 10 min，将约 400 μl，含蛋白质浓度为 0.1~0.5 μg/μl ( 见注释 2 ) 的上清液移至另一只管中。

( 5 ) 用 8 mol/L 尿素重复第 3 和第 4 步骤，合并上清液，调整容积到 600 μl。

3.3 抽提蛋白质的蛋白酶消化

( 1 ) 在总容积为 600 μl 的蛋白抽提液中添加 5 μl 外切赖氨酸蛋白酶工作液，在旋转振荡器上 37°C 消化过夜（见注释 3) 。

( 2 ) 在每个样品中分别加入 2300 μl 的 100 mmol/L 碳酸氢铵，30 μl 的 100 mmol/L 氯化钙，60 μl 的乙腈，10 μl 的胰蛋白酶工作液。终浓度为：1.6 mol/L 尿素，76 mmol/L 碳酸氢铵，1 mmol/L 氯化钙，2% ( V/V ) 乙腈，3.3 ng/L 胰蛋白酶。

( 3 ) 在旋转振荡器上 37°C 消化 24~48 h。添加 60 μl 甲酸使终浓度为 2%，将样品保存在 -20℃ 备用。

( 4 ) 用 15 ml 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 SeP- Pak 层析柱，然后用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的双蒸水清洗柱子 4 次。

( 5 ) 吸取 3 ml 蛋白酶消化液加样到已平衡好的 C18 Sep-Pak 层析柱上，收集流出的液体，再重复慢速过柱两次。用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的双蒸水洗柱子，洗脱盐及其他松散结合物质。再用 3 ml 含有 0.1% 的甲酸的 90% 乙腈溶液将肽段从 C18  Sep-Pak 柱上洗脱下来。

( 6 ) 用真空干燥浓缩机将上述洗脱液浓缩到约 500 μl。16000 r/min 离心 10 min，如果还有沉淀，取上清液，去沉淀。继续用真空干燥浓缩机浓缩样品到 50 μl，用含有 0.1% 甲酸的双蒸水稀释到 200 μl。

( 7 ) 用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 Spec- Plus 固相萃取移液器吸头，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的双蒸水冲洗 5 次。

( 8 ) 吸取 200 μl 肽段溶液加样到已平衡好的 C18 Spec-Plus 固相萃取移液器吸头上，收集流出的液体，再重复慢速过柱两次（见注释 4) 。用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的双蒸水冲洗柱子 5 次，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液将肽段洗出。

( 9 ) 用真空干燥浓缩机将上述洗脱液浓缩到约 10 μl，此溶液可直接上样到双相 Mudpit 层析柱。

3.4 制备带喷雾发射器的二维（SCX/RP) 纳升级高效液相色谱层析柱

( 1 ) 层析柱的制备：将一根长 25 cm，内径为 100 μm，外径为 360 μm 熔融石英毛细管推入一个激光拉制仪中，留一截 3~8 μm 的熔融石英毛细管头部。这样它既可以用作离子源针头，也可用作连接到质谱仪进样口的层析柱 [ 25 ]。

( 2 ) 将装有悬浮在甲醇溶液里填充材料的微型离心管放入压力室中，并盖好盖。将毛细管的钝头用金属箍与上盖拧紧相连，深度与填充物质一致，拧紧金属箍后，气室加压到 500 psi，将悬浮在甲醇溶液中的填充材料推入到层析柱中，当填充材料被装填到毛细管的 3~8 μm 的尖头时，甲醇通过柱子流向其顶部，在毛细管中先装入 4 cm 强阳离子交换（SCX ) 填充物，然后再装入 8 cm 反相层析（C-18 ) 填充物。

( 3 ) 用 PEEK T 形管连接器将填充好的柱子与高效液相色谱（HPLC) 连接，这个 T 形管连接器的金线电极（与质谱仪的高压电源相连）为层析柱上游提供电压，与柱子的洗脱溶液形成液相连接。

( 4 ) 用 HPLC 缓冲液 B 洗层析柱 1 h，流速为 1 μl/min，使柱体填充物完全填实。

( 5 ) 在使用前，用 HPLC 缓冲液 A 平衡柱子 1h，流速为 1 μ/min。