可溶性糖的硅胶G薄层层析(thin layer chromatography,TLC)
一、实验目的
1.了解薄层层析测定可溶性糖的原理。
2.掌握硅胶G 薄层层析的操作方法。
二、实验原理
薄层层析(简称TLC)是一种微量而快速的层析方法，是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中常用的支持剂，在吸附剂或支持剂中添加合适的粘合剂后再涂布，可使薄层紧贴在玻璃板上。
硅胶G
是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12％~13％的石膏(CaS04)，它可以把一些物质从溶液中吸附于自身表面。利用它对各种物质吸附能力的不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分离。例如，糖在硅胶G
薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个末显色的斑点从薄层上与硅胶G
一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G
上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出各组分的含糖量。薄层层析与其他方法比有明显的优点：层析时间短、样品用量范围大(1μg~0.5g)、观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高10~100倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。而且薄层层析法操作方便，设备简单，所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。
三、仪器和试剂
仪器
烘箱、吹风机、薄层玻板 (20cm×20cm)、分光光度计。
试剂
1. 1％糖标准溶液：取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各l00mg，分别用75%的乙醇定容10mL，使其浓度均为10mg/mL。
2. 0.1mol/L 硼酸(H3BO3)溶液。
3. 层析溶剂：氯仿：甲醇＝60:40(体积比)。
4. 苯胺—二苯胺—磷酸显色剂：
取1g 二苯胺、1mL 苯胺和5mL85％磷酸溶于50mL 丙酮中。
5. 蒽酮试剂：
称取 0.2g 蒽酮和1g 硫脲于烧杯中，缓缓加入100mL 浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液．将其贮存于棕色瓶中，最好现配现用，置冰箱中可存放2周
四、操作步骤
(一) 硅胶G 薄层板的制备
取硅胶G 粉30g，加入75mL 0.1mol/L 硼酸溶液中，调匀后铺于洁净、平整的玻板上，将铺层后的薄板于100℃烘箱中烘干。取出后即可使用，亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。
(二) 糖在硅胶G 薄层上的分离
选取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm
的直线上选4个点，各点间距2cm。用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5~10μg，斑点直径不超过2mm，待薄层上样品自然干操后，将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm
处时取出薄板，前沿作一记号，于60℃下烘干2～3h(或在空气中晾干)，除尽溶剂后均匀地喷上一层苯胺—二苯胺—磷酸显色剂，于85℃下烘干
10min，则各种糖分别显出不同的颜色。
(三)糖的定量测定
分别取5块干硅胶G 板，在每块板上间隔均匀地点上同样的5个样，即每块薄板上分别点上1μL、2μL、3μL、4μL、5μL
的糖标准液5点，操作方法同上，待溶液前沿到达薄板顶端lcm
处时取出，挥发尽溶剂后，将每块板中间3个样品层析部位用玻璃盖住，左右面边层折部位用显色剂进行定位。根据已显色斑点的位置，用刀片刮下中间3个相应部位的硅胶G
并放入试管中。在上述各试管中加1mL蒸馏水，于室温下浸提1小时，取1mL 滤液加2mL
蒽酮试剂，于沸水浴中加热10min，冷却后用空白试样调零，在波长620nm 处测出各糖的消光值A620。
(四)结果分析
1．记下各斑点的位置、颜色，计算Rf 值，绘出层析图谱
