血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-5

（五）操作
1．直接测定法
在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm 和260nm 两种波长的吸光度。将280nm 及260nm 波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。
C = 1.45A280 — 0.74A260
式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml)；
A280nm：蛋白质溶液在280nm 处测得的吸光度；
A260nm：蛋白质溶液在260nm 处测得的吸光度。
本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。
为简便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm 乘以0.75 来代表其中蛋白质的大致含量（mg/ml）。
2．标准曲线法
1）标准曲线的绘制
取8 支干净试管，编号，按下表加人试剂。
紫外吸收法测定蛋白质浓度 ― 标准曲线的绘制

加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
2）样液测定
取未知浓度的蛋白液 1.0ml，加蒸馏水3.0ml，测A280,对照标准曲线求得蛋白质浓度。
四、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度
（一）目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
（二）原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
（三）实验器材
1．旋涡混合器
2．试管
3．吸管 0.10ml、0.50ml、1.Oml、2.0ml、5.0ml
4. 722 型（或7220 型）分光光度计
5．容量瓶1000ml
6．量筒100ml
7．电子分析天平
（四）实验试剂
1. 0.9% NaCI 溶液。
2．标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.lmg / ml ) ，准确称取牛血清白蛋白0.2g , 用0.9%NaCI 溶液溶解并稀释至2000ml 。
3．染液：考马斯亮蓝 G250 ( 0.01% ) ，称取0.19 考马斯亮蓝G250 溶于50ml 95％乙醇中，再加人l00ml 浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1OOOml。4 ．样品液：取牛血清白蛋白（0.lmg/ml）溶液，用0.9%NaCI 稀释至一定浓度。
五、操作
1．标准曲线的制备
取7 支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。
混匀，室温静置3min ，以第l 管为空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。
2．样液的测定
另取一支干净试管，加人样品液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0 ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm 处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意：
样品蛋白质含量应在10-100ug 为宜。一些阳离子如K＋、Na＋、Mg2＋、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS 等会严重干扰测定。