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周斌组合作发现心肌细胞的增殖活性具有区域性特点

2021.10.11

　　10月1日，国际学术期刊 Nature Communications 在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌组与上海交通大学胸科医院何奔组合作的研究成果“Cell proliferation fate mapping reveals regional cardiomyocyte cell-cycle activity in subendocardial muscle of left ventricle”。该研究首次利用细胞增殖示踪技术ProTracer研究了哺乳动物成体小鼠心脏中心肌细胞的增殖活性，揭示了成体后心脏心肌细胞增殖的位置具有特异性，为心肌细胞增殖和心脏修复再生研究提供了新的检测工具以及研究思路。

　　成体哺乳动物心脏中心肌细胞以很低的速率进行更新换代，因此在心脏损伤后不能及时再生，给心脏造成不可逆的损伤，同时极低的增殖速率也给检测心肌细胞的增殖带来了挑战。传统检测心肌细胞增殖的方法多是利用细胞增殖标记物染色，同位素掺入，核酸类似物掺入进行检测，但是这些传统检测方法在检测心肌细胞增殖时面临多种问题：只能检测单一时间点，无法进行长时程的追踪；心肌增殖的信号被其他类型细胞增殖的信号干扰，无法进行明确分辨；若借助流式细胞技术则很难提供原位的细胞增殖信息；长时间的核酸类似物掺入可能导致细胞的正常分裂受到影响。因此建立一种可以长时间特异性追踪心肌细胞增殖的技术对于解决心肌细胞增殖的问题至关重要。

　　基于上述存在的问题，周斌组研究人员利用谱系示踪技术建立了一种检测细胞增殖的技术——ProTracer，它可以特异性追踪体内心肌细胞的增殖。研究人员基于广泛应用的细胞增殖标记物Ki67构建了此前报道过的Ki67-CrexER小鼠（He et al., Science 2021），结合研究组开发的Dre-rox与Cre-loxP双同源重组系统，使得在Dre存在的情况下可以将Ki67-CrexER转变成Ki67-Cre，从而根据Cre重组loxP报告基因的结果持续追踪Ki67基因的活性。之前细胞增殖领域内已经存在的Ki67-CreER谱系示踪小鼠，需要借助持续他莫昔芬（Tamoxifen, Tam）的诱导才有可能持续捕捉Ki67的活性。由于Tam在体内的作用时间较短，如果细胞发生了Ki67的活跃表达驱动了 CreER的表达但是体内此时没有可以让Cre入核的Tam，那么该细胞并不能被标记荧光，这部分信号将被遗漏。ProTracer系统可以依靠Tam驱动DreER入核将Ki67-CrexER同源重组变成Ki67-Cre，只要细胞进入细胞周期，Ki67开始活跃就会驱动Cre的表达并利用报告基因永久标记细胞。ProTracer一旦经由DreER启动，后续就可以持续不间断长时程地追踪细胞的增殖，而且可以根据DreER的选择实现特异类型细胞的增殖追踪，排除其他较快增殖的细胞类型的干扰，实现高分辨率、低信噪比的直观检测。

　　研究人员利用ProTracer研究了稳态以及损伤修复后成体小鼠心脏中心肌细胞进入细胞周期的情况。此前关于成体哺乳动物心肌细胞增殖的研究集中于利用同位素标记来研究人与鼠中心肌细胞的增殖。对人的心肌细胞研究主要在于利用冷战后14C进入大气后，以14C在心肌细胞核中的掺入比例推测心肌细胞的出生日期，进而推测人整个生命过程中的心肌细胞增殖速率。研究发现随着年龄增长心肌细胞的增殖速率变缓，从25岁约1%的年更新率降低至75岁时0.45%的年更新率（Bergmann et al., Science 2009）。另一研究利用多同位素成像质谱对掺入小鼠心肌核的15N同位素进行检测发现，小鼠成体后心肌细胞以0.76%的年更新速率更新，心肌梗死后会促进梗死区边缘的心肌细胞的增殖（Senyo et al, Nature 2013）。成体哺乳动物的心肌细胞增殖初步在定量上取得了一定进展，但是以往的这些研究借助于流式细胞技术，无法揭示细胞增殖的原始位置；或者引入了同位素使得检测变得困难，以及受到其他易增殖的细胞信号的影响较难获得高分辨的原位心肌细胞增殖信息。

　　研究人员首先利用广谱性的ProTracer（ProTracer可以在所有类型细胞中被启动）检测成体心脏中心肌细胞的增殖，利用流式分析、分离的心肌细胞计数、切片免疫荧光染色分析，他们发现小鼠成体心脏进入过细胞周期的心肌细胞随时间增长逐渐累积，直到半年后达到1.23%左右。考虑到R26-DreER启动广谱性ProTracer具有效率问题，该结果与Senyo等的DNA年复制结果是一致的。研究还发现进入过细胞周期的二倍体的心肌细胞比例明显高于未进入过细胞周期的比例，这说明了二倍体心肌细胞可能更容易增殖。随后研究人员利用靶向心肌细胞的腺相关病毒携带Dre来开启ProTracer实现了只追踪心肌细胞增殖的效果，首先建立了心肌细胞特异的ProTracer技术。排除了其他易增殖的细胞信号的影响，研究人员能够更直观地原位检测心肌细胞增殖。借助心肌细胞特异的ProTracer技术，研究人员发现成体心脏中进入过细胞周期的心肌细胞更趋向于分布在左心室靠近心内膜侧、乳头肌、室间隔靠近左心室侧（后文统称这些位置为左心室心内膜侧肌肉，图），统计发现80%以上进入过细胞周期的心肌细胞分布于上述位置。为了排除腺相关病毒可能存在的位置靶向性导致的假阳性，研究人员构建了Tnnt2-DreER来开启ProTracer，借助这一版本的心肌细胞特异性ProTracer，研究人员再一次确认了成体心脏心肌细胞进入细胞周期的位置特异性。利用一套依赖于另一个细胞周期基因Ccna2的ProTracer技术，以及持续的EdU喂水和Ki67蛋白表达检测实验，研究人员最终确认了成体心肌细胞进入细胞周期的这一位置特异性。

　　ProTracer借助追踪Ki67在细胞内的活性记录小鼠体内细胞的增殖，但是Ki67也表达在那些仅仅完成了DNA复制或者核分裂而未完成完整细胞分裂的细胞中，鉴于成体后心肌细胞存在多倍体化和多核化，所以研究人员也一直称他们检测到的心肌细胞为进入过细胞周期的心肌细胞。为了进一步研究成体心脏中确切的心肌细胞增殖数目，研究人员利用低剂量的腺相关病毒来稀疏标记进入过细胞周期的心肌细胞，通过统计位置紧邻的被标记的心肌细胞来测算完成了细胞周期的心肌细胞的数目。研究人员发现大约13%进入过细胞周期的心肌细胞完成了细胞分裂，该结果与Senyo等的同位素掺入结果也是相符合的。而且这些增殖的心肌细胞也有超过80%集中于左心室的心内膜肌肉侧。研究人员进一步利用ProTracer技术研究了心脏损伤下的心肌细胞再生来源，他们发现心肌梗死和主动脉狭窄都会在一定程度上促进心肌细胞进入细胞周期心肌梗死后梗死周围区的心肌细胞更多地进入细胞周期。利用ProTracer技术，研究人员也发现心肌细胞增殖的位置特异性是受Hippo信号通路下游的转录因子YAP调控的。

　　综上，该研究的亮点在于利用一种新开发的细胞增殖示踪技术——ProTracer，发现了成体后心肌细胞增殖的位置特异性，为心肌增殖研究领域提供了新的研究工具，也为心脏修复再生领域提供了新的研究思路。

　　分子细胞卓越中心博士研究生刘秀秀、蒲文娟和何灵娟（现西湖大学）为该论文的共同第一作者，分子细胞卓越中心周斌研究员和上海交通大学胸科医院何奔教授为该论文共同通讯作者。该工作得到了英国阿斯利康Qing-dong Wang教授，上海交通大学上海胸科医院沈红玲教授，华东师范大学钟涛教授，上海交通大学新华医院孙锟教授和加州大学洛杉矶分校Reza Ardehali教授的大力支持。感谢分子细胞卓越中心动物平台和细胞分析技术平台对本研究的大力支持，感谢中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部门的经费支持。