酶联免疫吸附法的原理和操作办法

　　1、原理

　　对 E.coli O157：H7 抗原具有高度特异性的多克隆酶联免疫专有抗体被绑在酶标板的微孔内，加入增菌后的测试样品和阳性质控后，如有 E.coli O157：H7 ，抗原存在则与微孔内的抗体结合形成抗体抗原复合物，没参加反应的物质被冲洗掉。加入碱性磷酸酶抗体接合剂，使 E.coli O157：H7 抗原与酶结合，孵育后将未结合的接合剂冲洗掉。加入酶底物ρ-磷酸硝基苯，在405～410nm 处读数。

　　2、仪器及试剂

　　培养箱；水浴锅；酶标板冲洗器；酶标仪（405～410nm）；细菌过滤器（syring）；加样器、涡旋混合器等；改良新生霉素仪大豆肉汤（mTSBN）；检测试剂盒：Assurance EHEC EIA。

　　3、操作方法

　　首先称取25g 祥品，加入225mL 灭菌的改良新生霉素胰大豆肉汤（mTSBN）中35～37℃增菌18～28h，然后取1mL 混匀好的增菌液100℃水浴20min，冷却后进行分析。具体方法可根据试剂盒操作说明进行，与沙门氏菌多克隆酶免疫法（AOAC 992.11）类同。

　　四、自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）

　　这是一种利用全自动酶联荧光免疫分析仪（VIDAS）检测 E.coli O157：H7 的方法，经选择性增菌后全过程都由分析仪自动操作完成，可在45min 内获得检测结果。阳性结果还可以再用同一仪器进行免疫浓缩后分离鉴定。本方法的实验原理及仪器设备与沙门氏菌VIDAS 自动荧光酶标仪筛选法类同。 E.coli O157：H7 的增菌选用mEC＋n肉汤（含新生霉素的改良 EC 肉汤）和奶制品用 mTSB-A（含吖啶黄的改良胰酶大豆汤）。

　　 E.coli O157：H7 的筛选用 VIDAS ECO 试剂条，上机后45min出结果。经 ECO 检测阳性的样品再用 VIDAS ICE 试条对未经灭活的增菌液进行 E.coli O157：H7 的免疫浓缩反应，上机40min 内获得结果。用经过浓缩后的样液划选择性平板，进一步分离鉴定。具体使用可参照产品使用说明进行。