质谱沙龙第二十四期活动报道
2009年12月5日下午，质谱沙龙第二十四期活动在中国食品发酵工业研究院举行。参加本次活动的除了有来自中国食品发酵工业研究院、第二炮兵总医院、清华大学、AB公司、军事医学科学院、北京科技大学的老朋友外，还有来自中国疾病预防控制中心、三○九医院、总后药检所、地科院测试中心、中国水产科学研究院、北京化工研究院、上海仪真公司等的新朋友。
第二十四期质谱沙龙活动现场
LC/MS/MS在生态地球化学研究中的应用
中国地质科学院国家地质实验测试中心 王晓春 博士
首先，中国地质科学院国家地质实验测试中心的王晓春博士做了题为《LC/MS/MS在生态地球化学研究中的应用》的报告。LC-MS/MS联用技术操作简单、准确度好、灵敏度高、测定时间短，可提供可靠的、精确的相对分子量和结构信息，因此是测定痕量有机物的理想方法。
LC/MS/MS对水及生物样品中全氟有机化合物的分析方法
全氟有机物Perfluorinated compounds（PFCs）1951年由3M公司研制成功，已有50多年历史，具有热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性。它常用于炊具、合成洗涤剂、灭火器、涂料和皮革，PFCs包括：全氟羧酸PFCA（如全氟辛酸PFOA）、全氟烷基磺酸盐PFAS（如全氟辛烷磺酸PFOS）、全氟亚磺酸盐、全氟磺酸胺、Telomer Alcohols等。它具有难降解性、生物蓄积性和沿食物链在生物体内富集的作用。比如，其中的全氟辛烷磺酸（PFOS）具有很强持久性，在任何水解、光解和生物降解环境条件下都不降解，并且会远距离迁移。证据是：监测数据显示北半球不同区域都有高浓度PFOS，特别是在远离人为来源的北极生物圈中也有高浓度PFOS。PFCs的研究已成为国际上环境科学和毒理学研究的热点。
已报道过的分析PFCs的方法可用单级四极杆液质、液质质（比如Q-TOF或三重四极杆）、气质联用GC/MS、液相荧光等。我国也出台了PFOS的分析测试标准：GB/T 23243-2009《食品包装材料中全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)的测定 高效液相色谱-串联质谱法》，GB/T 24169-2009 《氟化工产品和消费品种全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)的测定 高效液相色谱-串联质谱法》也即将实施。王博士他们使用的是三重四极杆液质联用的负离子检测模式。
在前处理方面，有以下几种处理方法（王博士介绍其实验主要采用第1、2种前处理方法）：
- 固相萃取法（水样萃取、净化）
- 离子配对——MTBE（甲基叔丁基醚）萃取——固相萃取（血清、肝脏、乳液等）
- ACN（乙睛）萃取（生物组织，全血）
- 甲醇和醋酸超声提取（淤泥、生物组织）
- 碱性消化（生物组织）
- 酶消化（鸡蛋）
基于以上背景，王博士利用LC/MS/MS研究了水及生物样品中全氟有机化合物的分析方法。
王博士所在的研究小组研究了 “沈阳地区水环境中PFCS的时空分布特征及鱼、家禽样品中的含量水平”， 布设了40多个采样点（包括水样、土样、家禽），在浑河和细河取水样，采用高效液相色谱/电喷雾负电离源串联质谱（1100-Quattro Ultima Pt，使用Betasil C18和JJ-50 2D色谱柱，醋酸胺和甲醇溶液流动相以及100%甲醇）进行研究，对于化合物PFPrS、PFEtS和PFPeA用JJ-50 2D色谱柱定量，其余均用Betasil C18柱定量。结果表明，对于全氟羧酸PFCAs（PFDA、PFNA、PFOA、PFHpA）分布而言，大部分结果表明，流经大城市（沈阳）后，PFCAs的含量升高，只有PFHpA没有反映这种情况；而对于全氟烷基磺酸盐PFASs（PFOS、PFBS、PFHxS）而言，所有化合物测定结果均表明，流经大城市（沈阳）后，PFASs的含量升高。另外，王博士课题组还比较了浑河与细河水样品中PFASs和PFASs的浓度；比较了国内几个城市自来水中PFOS与PFOA浓度，表明国内某大城市的PFOA值要高出其它城市大于一个数量级；比较了国内各省生物样品(鱼)中PFCs的含量，表明某省/地区鱼体中的PFCs含量最高。
LC/MS/MS在大骨节病可以治病因子同步分析中的应用
王博士还向大家介绍了他正在进行的课题“LC/MS/MS在大骨节病可以治病因子同步分析中的应用”。
大骨节病病人症状
大骨节病（KBD）是一种原因不明的地方病，是一种以发育期儿童软骨变形坏死为主要病理特征的地方病。目前关于KBD的致病原因有以下几种假说，很多学说都有缺陷，王博士的课题组只只考虑真菌霉素中毒假说和生物地球化学说。从综合分析各个假说可得出一个结论，即大骨节病不可能是单一致病因素引起的，所以综合考虑不同致病因子间的协同作用可能是大骨节病病因研究的一个方向。这就需要建立一种能同时检测T-2毒素和硒形态的方法，明确大骨节病两种致病因子间的协同作用。
其中，T-2毒素的分析方法有GC-ECD、GC-MS/MS、HPLC-FD（荧光）、LC-MS、LC-MS/MS。课题组选用LC-MS/MS方法，样品制备简单，且具有高灵敏度。而硒形态分析也包括多种方法，选用LC-MS联用技术，也是硒形态分析的发展方向之一。
课题组的主要工作目标是：在建立一种能对大骨节病可疑致病因子（镰刀菌毒素与硒缺乏）进行同步分析的LC/MS/MS分析方法基础上，详细研究此两种主要可疑致病因子间的协同作用以及对该病的实际贡献程度。在研究中目前的思路包括用衍生试剂将无机硒转化为有机硒，再建立对T-2毒素和有机硒同时检测的LC-MS/MS（1200-API 4000）方法。
报告的最后，王博士还列举了一些LC/MS/MS在生态地球化学领域的其它应用实例：
- 环境中的药物：分析地表水和地下水中的药物；
- 食品添加剂：比如三聚氰胺、孔雀石绿/隐性孔雀石绿；
- 元素形态分析中的应用：如砷、硒形态定量和定性分析等。
本网前沿Lab：国 家 地 质 实 验 测 试 中 心
QTRAP型MS/MS仪的同时定性和定量特点
AB公司应用工程师 张克荣
AB公司的应用工程师张克荣工程师做了题为《QTRAP型MS/MS仪的同时定性和定量特点》的报告，介绍该的Q TRAP®仪器特有的功能，包括同时做定性定量以及在定性方面的优点。
QTRAP与三重四极杆不同之处在于Q3，它既可以作为一个三重四极杆的质量分析器又可以作为一个线性离子阱的质量分析器，这两个功能的切换只需1ms。正因为这个Q3线性阱，离子可以进行存储，QTRAP的MS/MS子离子扫描灵敏度（EPI模式）比三重四极杆高500倍，因此具有很强的定性功能。同时，还避免了传统离子阱质谱的低质量截止效应（1/3效应）。另外，相比传统离子阱，Qtrap还有从MS到MS/MS、MS3，信号强度下降少的优势：以Trocade为例，传统离子阱MS强度为3.54E7 cps，MS3为3.07E5 cps；而QTRAP的MS强度为5.1E6 cps，MS3为1.8E6 cps。
QTRAP的原理、功能及优势
张工还介绍了QTRAP的IDA（信息相关采集Information Dependent Acquistion）模式，可以使发现和确证一次完成;反之若没有这种IDA模式，发现和确证要进行两次甚至多次的实验。IDA的主要原理是，首先进行一次预扫描（预扫描可以是MRM、一级增强全扫描EMS、中性丢失扫描NL、增强多电荷扫描EMC等），一旦预扫描的强度值高于设定阈值，即自动触发EPI扫描，在线采集MS/MS图谱用于确证，比如可以到谱库中检索（AB公司QTRAP仪器中有2000余种化合物图谱）。比如采用MRM预扫描触发的IDA模式，即可一次实验完成筛查、定量、确证。这个功能的好处是，在如食品安全等测定时，只用MRM很难消除内源物的干扰，用触发的IDA模式进行在线MS/MS确证，可以大大减少内源物的干扰。
另外，用特有的MRM3模式，特异性更强，针对某些混合物，有时候能进一步减少内源物干扰、降低背景噪音，提高灵敏度。
接下来，张工介绍了几个应用。
一、牛奶/奶粉中玉米赤霉醇的LC-MS/MS分析方法
在该例中，用QTRAP做MRM，分别为：α-玉米赤霉醇（MRM通道：m/z 321 > 277，出峰时间7.2 min），β-玉米赤霉醇（MRM通道：m/z 321 > 303，出峰时间7.7 min）。但空白样品在4.4 min时对m/z 321 > 277有响应，在7.88 min时对m/z 321 > 303有响应。应用MRM触发的IDA扫描来进行实验，可以快速地对4.4 min、7.2 min、7.7 min、7.88 min出现的峰进行MS/MS扫描和谱库检索确认，最终发现4.4 min、7.88 min的MS/MS谱不匹配，因此是内源性干扰物；而7.2 min和7.7 min的分别确证为α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇。据介绍，很多进出口检验检疫的用户使用QTRAP的这种方法开展检测，已大大降低了假阳性率。
二、药物代谢物鉴定
张工先介绍了药物代谢常见的一相和二相代谢物。以前，二相代谢物常采用母离子/中性丢失扫描来做，但对于一相代谢物鉴定比较困难。张工介绍说，QTRAP的特色就是具有多种复合的扫描模式，因此可以找到更多的代谢物；同时介绍了特色的pMRM方法和多个母离子/中性丢失扫描方法。pMRM是一种查找完整代谢物的方法，它可以根据母药结构，自动组合MRM离子对，一次分析可作几百个MRM“预测扫描”，并进行准确的MS/MS定性。而利用多个母离子/中性丢失扫描方法，可以对结构做特征的过滤，对代谢物反应检测也是一种理想的方法。
在实例中，介绍了Verapamil（维拉帕米）代谢物的鉴定方法，共检测到35个代谢物。其中，一次进样用pMRM的预测扫描，发现了30个代谢物;通过母离子/中性丢失扫描又发现了5个新的代谢物。张工介绍说，这个实验是和Thermo的一篇Orbitrap报告来比较的，在那篇报告里，鉴定了14个代谢物。
三、对活性化合物的鉴定和结构分析
张工举例了对中药肉苁蓉（Cistanche deserticola Ma）的鉴定，它的主要活性成分是苯乙醇苷类化合物（Phenylethanoid glycosides, PeG），主要有两个代表物，一个是麦角甾苷，一个是松果菊苷。根据苯乙醇苷类的主要质谱碎片，利用Qtrap特有功能设计试验，通过EMS-ER-IDA-EPI，PREC-ER-IDA-EPI，NL-ER-IDA-EPI扫描模式，一次进样同时得到样品中所含化合物的分子离子和高分辨率的质谱图，从而确证化合物的分子量；并得到其MS/MS图谱，可对化合物进行结构分析。该实验发现了32种苯乙醇苷类的化合物。
四、中毒药物急救检测
二炮总医院的李鹏飞老师曾介绍过这种用QTRAP建立的多目标筛查流程，不再详述。
中毒药物急救的Qtrap LC-MS/MS筛查流程
最后，张工总结说：QTRAP技术将串联四极杆与线性离子阱技术有机结合在一起，为临床医学、生物标志物、蛋白组学、代谢组学、药物代谢物鉴定、环境分析、残留药物、毒物的筛查、食品安全分析等的研究提供了可靠的技术平台。
国外使用在线SPE-液相色谱-质谱联用进行药物代谢研究与临床诊断的情况与最新进展
上海仪真公司 张建伟
上海仪真公司的张建伟老师向大家介绍了Symbiosis™在线SPE-液相色谱-质谱联用系统。张老师讲到，在线SPE与离线SPE不同之处在于，在线SPE不需要进行洗脱、氮吹以及重定容的步骤，只需阀切换过程即可直接进样到液相色谱进行上样，且为全量上样，即将样品完全上到分析柱中，而离线SPE只取十分之一或部分样品上样。
Symbiosis™在线SPE-液相色谱-质谱联用系统主要由用液相色谱柱相连的Symbiosis XLC检测器和质谱、荧光等检测器组成，采用SPARKLINK软件进行控制。如采用AB公司的质谱，可以直接用Analyst软件反控Symbiosis™设备中的任何一个元件。张老师通过播放动画，生动地向大家展示了XLC在线分析流程。整个过程连续，自动化程度高，大大节约了时间，SPE的时间几乎可以忽略。
Symbiosis™的分析平台由：样品仓、自动进样器、LC小泵、小柱更换单元以及高压注射泵组成。在XLC/MS分析过程中，系统将样品盘从样品仓传送到自动进样器中，然后通过切换将样品进样到活化的SPE小柱中，经过固相萃取的淋洗和洗脱后，通过阀切换全量进样在线进样到LC分析柱上，然后进行液相分离和质谱分析。
目前，Symbiosis™在线SPE-液相色谱-质谱联用系统在国外应用广泛，90年代中期至今已发表应用文献数百篇，如美国辉瑞研发中心发表的《全自动在线固相萃取-LC-MS/MS 方法的开发和应用：高通量直接分析血浆中的药物化合物》、荷兰Spark Holland发表的《在线SPE/LC/MS/MS 测定血浆中的维生素》等。
张老师最后列举了几个Symbiosis™应用实例：血浆中的25-羟基维生素D2/D3检测、动物血浆中药物检测、人血浆中他林络尔的药物动力学研究、人尿液中碱性药物的在线检测，大家进一步了解了在线SPE的工作方式。
张老师讲后，回答了大家感兴趣的几个问题，比如：Symbiosis使用的SPE小柱可反复使用，同一方法下可以用十几次。活化溶剂跟离线的溶剂是一样的。血浆最好先沉淀蛋白后再上样，这样可使SPE柱子使用时间更长。该系统自带SPE的粒径更小（Spark 萃取小柱粒径：7-10 µm vs. 普通：40 µm），可以减少洗脱的溶剂量，从而提高灵敏度。Symbiosis的最大好处是进行高压正相、高精度的固相萃取，可以精确、重现地取得目标化合物，把不需要的化合物去掉，并且是高通量的。
注：上海仪真公司是瑞士Spark公司的在线SPE-液相色谱-质谱联用系统的代理商。
报告下载：国外使用在线SPE-液相色谱-质谱联用进行药物代谢研究与临床诊断的情况与最新进展
