周强组解析首个人源氨基酸转运体LAT1–4F2hc复合体结构
L 型氨基酸转运体1，简称LAT1（也被称作SLC7A5），属于反向转运蛋白，能向胞内转运不带电氨基酸，此外还参与药物的吸收、甲状腺激素及激素前体物质如L-DOPA的跨膜运送。LAT1和 LAT2（SLC7A8）同属于SLC7 家族，其介导氨基酸反向协同转运过程不依赖于钠离子，其中LAT1也不依赖于pH。
LAT1和LAT2具有相似的胞内胞外底物选择性，LAT1倾向于转运较大的不带电氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和组氨酸【1】，LAT2的选择性更广，但一般而言底物亲和力更低。在组织特异性上，两者表达也有差别，另外LAT1在多种肿瘤细胞中检测到表达上调，使其成为潜在的抗肿瘤药物靶点【2】。在结构上，LAT1通过二硫键与4F2 细胞表面抗原重链糖蛋白（4F2 cell surface antigen heavy chain，也叫SLC3A2）共价连接形成LAT1-4F2hc复合体【3】。尽管已有工作解析了细菌来源的LAT1-4F2hc同源晶体结构及人源的LAT2-4F2hc负染的低分辨结构，但人源LAT1-4F2hc复合体亚基之间的相互作用及转运的工作机制仍未明了。
2019年3月14日，西湖大学生物学研究所周强研究员团队在Nature发表了题为Structure of the human LAT1–4F2hc heteromeric amino acid transporter complex的论文（第一单位为清华大学），该研究利用冷冻电镜技术，研究者首次解析了人源LAT1–4F2hc复合体整体分辨率3.3Å的高分辨结构，及LAT1–4F2hc与抑制剂2-amino-2-norbornanecarboxylic acid (BCH)结合的3.5Å的结构。
研究者在HEK293F细胞中外源大量表达人源LAT-4F2hc蛋白，纯化后蛋白用于冷冻电镜样品制备及体外的功能学研究。首先蛋白被重构入脂质体进行体外转运实验，通过检测复合体对同位素标记的亮氨酸[3H]leucine的吸收速率，实验测定了LAT1-4F2hc催化转运的Km值，确定体外表达纯化蛋白具有活力。其他LAT1底物与[3H]leucine的竞争性实验表明，[3H]leucine的转运活力可被苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、L-DOPA、组氨酸、甲硫氨酸、BCH和异亮氨酸抑制，抑制程度依次降低。同时研究者单独纯化了LAT1蛋白，进行了体外重构脂质体的转运实验，发现LAT1单独几乎无转运活性，有力地说明了4F2hc在转运过程中发挥着重要作用。
该工作解析了人源LAT1–4F2hc复合体整体分辨率3.3Å的高分辨结构，这是已发表工作中，冷冻电镜解析的高分辨无对称性的最小膜蛋白，可见区部分不到100kDa。此外研究者还收集了加入抑制剂JPH203的蛋白样品的数据，功能实验证明了JPH203对重构入脂质体的LAT-4F2hc复合体的抑制，但3.3Å结构中并没有看到抑制剂的密度。三个结构HAT + BCH，HAT + JPH203， apo-HAT（未外加药物的结构）整体构象几乎一致，通过与apo-HAT密度比较，研究者在HAT + BCH结构中发现一处可以较好匹配BCH分子形状的密度（下图）。
LAT1–4F2hc复合体整体结构呈现朝胞内打开的构象，4F2hc上有四个糖基化位点。研究者看到了BCH的密度，对BCH周围有相互作用的氨基酸突变后，发现带有点突变的复合体对亮氨酸的转运能力下降，这和根据与GkApcT和 AdiC转运体序列比对结果推测的转运路径相符，根据与其他氨基酸转运体的序列比对结果与对结果分析，找到Tyr117, Phe252, Trp257, Asn258, Tyr259和 Arg348等氨基酸，绘制了可能的氨基酸转运路径。
对结构的分析中发现，4F2hc与LAT1除形成二硫键外，还有多个相互作用的界面，由多个氨基酸参与形成，有意思的是，这些有相互作用的氨基酸均在远离底物转运路径，但某些关键相互作用氨基酸发生突变，会显著降低氨基酸的转运能力，推测4F2hc像一个支架，支持底物转运过程中LAT1的变构。
基于对高分辨结构的解析及功能实验验证，对LAT1–4F2hc复合体可能的工作机制提出了如下的模型：
总的来说，该工作中LAT1-4F2hc复合体高分辨结构清晰的密度，为疾病相关突变的研究提供了结构基础，对LAT1-4F2hc转运底物机制的探究具有重要意义，LAT1-4F2hc与抑制剂BCH结合的构象为针对LAT1-4F2hc的抗癌药物研发提供帮助。
据悉，西湖大学生物学研究所周强研究员为此文的通讯作者，清华大学博士生鄢仁鸿、赵馨为共同第一作者。
通讯作者简介：
周强（1982 -），黑龙江齐齐哈尔人。2000-2004年本科就读于清华大学，获学士学位。2004-2012年博士师从隋森芳院士就读于清华大学，获博士学位。博士毕业后继续留实验室从事博士后研究工作。2015年博士后出站后在清华大学医学院颜宁教授课题组任副研究员。2019年初将加盟西湖大学担任西湖学者、特聘研究员，开展独立研究工作。（信息来源于西湖大学官网）
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1011-z
参考文献
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Kanai, Y. et al. Expression cloning and characterization of a transporter for large neutral amino acids activated by the heavy chain of 4F2 antigen (CD98). J. Biol. Chem. 273, 23629–23632 (1998).
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