检测细胞凋亡的实验方法比较-2
二、细胞凋亡的细胞化学测定
细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定。根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法。
碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测
早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI)不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。坏死细胞红色荧光最强。
膜联蛋白（annexin）V标记
正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。
检测方法：1×106细胞/ml细胞悬液，先后用膜联蛋白V--FITC及PI染色，流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（cytogram），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份。左下象限代表正常细胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡细胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+）,左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+）。用生物素标记膜联蛋白V还可以作体内试验。将生物素标记膜联蛋白V注射小鼠体内，30分钟后处死，迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，DAB显色，光镜下观察凋亡细胞。
DNA琼脂凝胶电泳法
细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180-200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。自Wyllie把内源性核酸内切酶降解产生“梯形带”与细胞凋亡相联系以来，“梯形带”被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标。尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的DNA降解，对这一指标提出质疑，本方法仍被广泛应用。但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测。
检测方法：培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已锭的1％-2％的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最后在紫外线灯下观察和摄影。
DNA裂解的原位检测
在细胞水平检测DNA裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞，细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的继裂（缺口，nick）。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸在3`-OH端予以显示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脱氧核苷酸转移酶（TdT），前者使核苷酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在，其方法被称为未端记（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的应用已很广泛，其优点是可用于原位标记，可用于病理组织，并可进行定量分析。值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现 阳性反应。组织或细胞外理不当时可出现假阳性。因而，TUNEL等方法对凋亡细胞的标记是选择性的。而不是特异性的，TUNEL或其他DNA裂解原位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应。
检测方法：石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，显色（辣根过氧化物酶标记可用DAB显色，碱性磷酸酶标可用NBT+BCIP显色），复染，脱水，封片。凋亡细胞核呈现蓝色（NBT+BCIP显色）或者棕黄色（DAB显色）。
凋亡蛋白质酶（Caspase）-3及其底物的检测
凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（Asp）残七C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。基中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。活化的凋亡蛋白质酶-3仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。一般采用人工合成四肽荧光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白质酶-3在D与AMC之间水解，释放荧光物质、AMC，后者在紫外线激发下发出波长为430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶-3的活性。由于醛对凋亡蛋白质酶-3的水解活性抑制作用，因此同时加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白质酶-3对DEVD-AMC的水解，不产生荧光。这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋白质酶-3的活性分析更有特异性。但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对活化的凋亡蛋白质酶-3亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不能令人满意。
检测方法：培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液。加入凋亡蛋白质酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同时用不加底物的样品作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强。如加入DEVD-AMC时再加入DEVD-CHO，样品释放的荧光强度与对照样品无差异。
凋亡蛋白质酶-3导致细胞凋亡是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋亡蛋白质酶-3底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡。PARP是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000及相对分子质量为25000的两个片段，用运载相对分子质量为85000片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡。细胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白质酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸残基形成一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞。另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（actin）被水解后产生一种称为“fractin”的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认。总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法。
三、展望
除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现。尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制。在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难。在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断。随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义。
◆ 有关细胞爬片
1. 处理细胞爬片：用灭菌的去离子水将多聚赖氨酸配成0.1mg/ml,处理载玻片过夜即可。用前再用去离子水漂洗一次，就可直接接种细胞！
2. 热疗对细胞内热休克蛋白70的诱导
陈必良1，安晓汾2，辛晓燕1，王德堂1，郭慧玲1（1第四军医大学西京医院妇产科，
陕西西安 710032；2第四军医大学吉林军医学院附属医院妇产科，吉林省 吉林市，132011）
【摘要】目的 探讨肿瘤细胞（以人卵巢癌细胞为例）在受热不同时间、不同间隔后细胞内热休克蛋白70表达的异同；明确人卵巢癌细胞对热耐受的敏感程度。方法 体外培养人卵巢癌细胞HO-8910，制成细胞爬片。加热温度设为42℃，实验分成两部分：①加热时间分别设为15、30、60、90、120、150min，加热后立即固定细胞；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的细胞爬片固定。然后将两组细胞爬片行HSP70的免疫组化染色，观察热疗前后HSP70的不同表达。结果 未加热细胞仅有少量HSP70的表达，随加热时间延长，HSP70的表达逐渐增多；加热后不同间隔HSP70的表达不同，间隔6 h HSP70的表达最强，随后逐渐减少，5-6天后，恢复至未加热状态。结论 ①温和加热时间过长可诱导HSP70的大量产生，从而使肿瘤细胞对热疗产生热耐受作用; ②卵巢癌HO-8910细胞对加热有较强的耐受性。
关键词：热休克蛋白70；免疫组织化学；热耐受；卵巢癌；
随着科学技术和医学科学的发展，对癌症的诊断和治疗有了长足的进步。高温治疗也称热疗（hyperthermia，HT，又叫温热疗法）,以其无手术痛苦、无术后并发症及无化疗及放疗带来的副反应而发展成为癌症治疗的有一种有效方法[1]。高温可导致肿瘤细胞死亡或者生长抑制，同时高温还可提高肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，因为肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。但在应用过程中也发现，随热疗重复次数的增加，热疗效果反而下降，会出现所谓“热耐受（thermotolerance）”现象，即第1次加温可影响第2次加温的生物学效应。这说明在热疗过程中，肿瘤细胞内生成了某些物质可降低其对热的敏感性。研究表明[2]，该现象与热休克蛋白家族尤其与热休克蛋白70（HSP70）的关系密切。本研究利用人卵巢癌细胞HO-8910受热后进行HSP70免疫组化染色，以了解在该细胞中HSP70的表达与加热之间的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 人卵巢癌细胞系HO-8910为分化差的卵巢浆液性囊腺癌细胞，由第四军医大学西京医院实验室提供。HSP70成套免疫组化试剂盒（产品编号 SA2077）及DAB显色试剂盒（产品编号 ED1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 加热处理 将细胞接种于含热灭活的15%小牛血清及双抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培养液中，常规培养。取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×105/ml。将1cm×1cm 大小的盖玻片置于24孔板中 ，每孔加入1ml的细胞悬液，制成细胞爬片。12 h后，将24孔板置于42℃培养箱中分别进行两种实验处理：①加热时间分别设6个时间点，即15、30、60、90、120和150 min，加热后的细胞即刻用0.01M PBS洗涤2次 ，用4%多聚甲醛固定细胞40 min，制成细胞爬片后置于4℃冰箱中保存备用；②将细胞加热120 min后，置于37℃细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144 h后的细胞爬片按照上述步骤处理细胞固定后备用 。
1.2.2 HSP70表达的免疫组化染色检测 将细胞爬片置于3% H2O2中室温孵育10 min，以蒸馏水洗涤后次滴加正常山羊血清封闭液室温放置20 min、滴加小鼠抗HSP70的抗体37℃ 1 h、滴加二抗及试剂SABC室温下各放置20 min，最后以 DAB显色, 染色时间统一设为5 min后终止。再经 苏木素轻度复染、常规脱水、透明和封片后，于显微镜下观察并照相。阳性细胞胞浆/胞核染成棕黄色。
1.2.3 统计学处理 采用等级资料的秩和检验
2 结 果
① 在42℃条件下，加热不同时间，卵巢癌细胞HO-8910细胞内HSP70的表达见表1。未加热的细胞内(见图1A), 有少量的HSP70表达，表现为胞浆内有极淡的淡黄染色；当42℃加温15 min时，细胞内HSP70的表达与正常细胞相比较无明显改变；加热30 min后 (见图1 ，可见胞浆内HSP70的染色略增强，但颜色仍较淡，仅限于胞浆，但胞浆染色数量增加；无胞核染色；加温60 min时(见图1C)，可见胞浆内HSP70的表达增强，表现为胞浆染色加深呈深黄色，染色细胞接近100%，但未见核染色；加温90 min时(见图1D)，胞浆内染色进一步加强呈棕黄色，偶尔可见核染色；加温120 min时(见图1E)，胞浆内染色表现为明显的棕黄色，核染色的细胞增多；加温150 min时(见图1F)，胞浆内呈深棕黄色，核染色细胞数进一步增多。
表1 HO-8910细胞温和加热不同时间的免疫组化染色
组别 例数 染色分级 胞浆染色的细胞数 核染色的细胞数
第一组 10 Ⅰ（淡黄色） 40%～50% 0
第二组 15 Ⅰ（淡黄色） 40%～50% 0
第三组 20 Ⅰ（淡黄色） 80%～90% 0
第四组 20 Ⅱ（深黄色） 100% 0
第五组 20 Ⅲ（棕黄色） 100% 5%
第六组 20 Ⅲ（棕黄色） 100% 10%～15%
第七组 20 Ⅳ（深棕黄色） 100% 20%～30%
※ P<0.05
注：①第一组为未加热细胞；第二组为42℃加热15 min；第三组为42℃加热30 min；第四组为42℃加热60 min；第五组为42℃加热90min；第六组为42℃加热120min；第七组为42℃加热120min
②免疫组化细胞染色分级标准——淡黄色Ⅰ级；深黄色Ⅱ级；棕黄色Ⅲ级；深棕黄色Ⅳ级
② HO-8910细胞加热120 min后，间隔不同时间进行免疫组化染色，结果表明, 加热后1 h，细胞染色呈深棕黄色仍保持强阳性（Ⅳ级），未见明显淡化；加热后4 h（见图2A），在所有染色的细胞爬片中，细胞染色表现为最强Ⅳ级，核染色的细胞约占50%；加热后6 h，几乎维持原水平；加热后12 h，可见胞浆染色有所淡化呈Ⅲ级棕黄色，但核染色未见明显减少(见图2 ；加热后24 h，染色程度呈Ⅲ级，染色细胞数量仍保持100%，但胞核染色明显减少，(见图2C)；加热后48 h，核染色全部消失，胞浆染色明显变淡呈Ⅱ级深黄色(见图2D)；72 h后，HSP70的表达进一步减少，细胞染色呈黄色（图 2E），随后，细胞染色每隔24 h即有明显淡化趋势，120 h后，细胞恢复至正常状态。
3 讨 论
肿瘤热疗学是近20年来迅速发展起来的一门新兴学科，为肿瘤患者的治疗带来了一线生机[3]。在临床应用过程中，发现肿瘤细胞可出现对热的耐受现象，尤其是当加热温度低于43℃（温和热疗）或加热时间过长时，更易发生热耐受[4]。热耐受不是细胞固有的特性、不遗传，是一种暂时现象，可能是热疗过程中肿瘤细胞产生的某些物质降低了其对热的敏感性。研究表明，肿瘤细胞在热应激发生后，最根本的变化是蛋白质谱的改变，表现为合成了一组特殊的高度保守的蛋白质——HSP或称为应激蛋白[5]，而正常蛋白质合成却被抑制。HSP是高热诱导的一种适应性蛋白，属于一种分子伴侣，主要功能在于当细胞处于应激状态时，可纠正新合成蛋白质的折叠和空间构象错误，协助转运蛋白质，抵抗应激原引起的变性，维持生理平衡，从而降低高热诱导的细胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的众多成员中,是最出色的热耐受预测因子[7]。加热过程中，伴随HSP70水平的升高，正常蛋白质的合成受到不同程度的抑制。加温后半小时无蛋白质的合成，随着HSP70的产生，蛋白质的生物合成逐渐恢复，肿瘤细胞的自我保护机制开始启动，从而引起肿瘤细胞对热的敏感性下降。
卵巢癌是威胁女性健康的生殖器三大恶性肿瘤之一，死亡率高，5年生存率不到50%。由于耐药及抵抗放疗效果的肿瘤细胞出现，为卵巢癌的治疗带来了新问题。随着热疗学理论的日趋成熟，已有研究将其应用于卵巢癌的临床治疗[8]。为了更好的将这一理论应用于临床，有必要了解卵巢癌细胞对热疗的敏感性。
本实验结果表明：① 人卵巢癌细胞HO-8910在未加热状态下，即有少量的HSP70表达，当给予温和加热（即加热温度为42℃）时，短时间内，诱导产生的HSP70未见明显增加。加热时间≥60 min后，尤其是加热时间超过120 min后，HSP70的表达明显增加，表现为随加热时间的延长而胞浆的染色加深，而且核染色阳性的细胞数量明显增多，这一结果表明细胞的热耐受已启动。②当细胞受热120 min后，停止加热，在最初的几个小时内（1～4 h），HSP70的表达保持加热当时的水平，4 h后，HSP70的生成达高峰，表现为染色程度最强，核染色细胞数量最多，说明此时细胞对热的敏感性最差。如再次加热，高温对该细胞的细胞毒作用最低。此后，随着时间的推移，HSP70的表达明显减少，5～6 d后恢复至正常水平。从实验结果还可看出，卵巢癌细胞HO-8910 对HSP70的表达有一定的时间依赖性，这也是临床上肿瘤热疗间隔需3～4 d的原因之一。此外，虽然可通过提高加热温度来减少HSP70的表达，但毕竟39℃～42℃的温度对于人体来说是能够承受的温度，因而，可考虑通过抑制热疗过程中HSP的生成而提高热疗的效率，国外已有相关的文献报道[9]。
一般而言，肿瘤细胞受热温度偏低，时间越长，越易形成热耐受[10]。人卵巢癌细胞HO-8910细胞在受热60 min后，就已有明显的HSP70的表达，而该细胞的恢复过程时间却长达5～6 d，这就提示我们肿瘤细胞对加热有一定程度的耐受性，而且热耐受因细胞不同而有不同的表现[11]，因此，在临床应用过程中需要考虑到这一要素。
