RNA－蛋白质的相互作用1

叶绿体RNA的体外加工与紫外交联分析RNA

RNA的合成

l      DNA模板的线性化

1．根据供应商的指导用合适的限制酶酶解含有DNA模板（如亚克隆在转录载体如pBluescript^®（Stratagene）上的菠菜叶绿体psbA基因）的质粒（Schuster and Gruissem1991）。

2．用DNA琼脂凝胶（Sambrook et al. 1989）分析线性化质粒以检查酶解是否完全。

3．用乙醇沉淀DNA（Sambrook et al. 1989），并重悬DNA沉淀于水中，调整线性DNA终浓度为200μg/ml。

l      DNA模板的转录

1．向微量离心管加入下列反应液

DNA模板                                    2μl（0.4μg）

反应缓冲液（5×）                                   4μl

DTT（40mmol/L）                                   0.5μl

NTP混合液（用于H－RNA或X－RNA）                 2μl

RNA酶抑制剂                         0.5μl（约15单位）

H₂O              对H－RNA加8.5μl或对X－RNA加2.5μl

为避免DNA的亚精胺沉淀，须在室温或37℃加各种试剂。

注：H－RNA 用于体外加工测试；X－RNA 用于UV交联测试

NTP混合液（H－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP   0.25mmol/L UTP

NTP混合液（X－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP

2．向反应液中加入2μl（对H-RNA）或8μl（对X-RNA）α-[³²P]UTP。

3．加0.5～1μl（即10～20单位）SP6，T3或T7聚合酶使反应终体积为20～20.5μl。

4．37℃温育40～60分钟。

5．加入15μl 5mol/L乙酸胺和100μl 100％乙醇沉淀RNA。

6．－20℃放置10分钟，4℃离心10分钟。

7．弃上清，空气和真空干燥RNA沉淀，用7μl甲酰胺染液重悬RNA。

8．在沸水中将RNA重悬液煮3分钟后，于冰上快速冷却，加样于6％的变性丙稀酰胺凝胶。

9．用Saran^®膜包上凝胶，对X光片曝光约20秒。

10．  切下含有RNA的凝胶片放入1.5ml微量离心管中。

11．  在该离心管中加入：

DEPC处理过的水                              180μl

DEPC处理过的乙酸钠（3mol/L, pH5.5）          20μl

DEPC处理过的EDTA（0.25mol/L）                 1μl

SDS（20％）                                    1μl

12．  在65℃温育1～1.5小时或40℃下过夜使RNA从凝胶中扩散出来。

13．  将RNA液转移入新的微量离心管中，加入500μl 100％乙醇，－20℃放置10分钟。计数契仑科夫辐射。

14．  离心10分钟沉淀RNA，弃去上清，真空下干燥沉淀，在进入下一操作前用合适的缓冲液重悬RNA。