双缩脲法和凯氏定氮法测定饲料中蛋白质含量的比较...
饲料蛋白质含量的测定通常采用国标规定的凯氏定氮法, 但用双缩脲比色法测定饲料中蛋白质含量也有报道( 陈革, 2003) 。本实验对多种饲料样品采用双缩脲比色法进行蛋白质含量测定,并将结果与凯氏定氮法进行对比和分析, 为实际工作中选择合理的方法进行饲料中蛋白质含量的测定提供科学依据。
1 双缩脲法原理
当尿素加热至150 ～160 ℃时, 可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲( 也叫双缩脲) 。其反应式如下:2H2NCONH2→H2NCONHCONH2 +NH3↑双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色的络合物, 此反应称为双缩脲反应。含有2 个或2 个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键( - CO- NH- ) , 在碱性溶液中与铜离子络合成紫红色络合物, 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比。据此可用吸收光度法测蛋白质含量, 该络合物最大吸收波长为540 nm。
2 实验材料
2.1 试剂双缩脲试剂:称取CuSO4·5H2O 1.5 g,酒石酸钾钠(NaKC4O6·4H2O) 6 g, 溶于500 mL 蒸馏水, 在搅拌下加入300 mL 质量分数10 %NaOH 溶液, 然后用蒸馏水稀释到1000 mL。配好后贮于塑料瓶中。蛋白质标准溶液( 7 g/100mL) , 10 %氢氧化钾溶液: 称取分析纯氢氧化钾50g 溶于500 mL 蒸馏水中。
2.2 主要仪器 粉碎机; 分样筛: 孔径0.45 mm( 40 目) ; 751 紫外/可见分光光度计; 电热恒温水浴锅; 分析天平: 感量0.0001 g; 电炉; 玻璃烧杯;具塞玻璃试管: 25 mL; 容量瓶; 托盘天平，比色计，罗维朋比色计等。
3 测定方法
3.1 标准曲线绘制将蛋白质标准液( 7 g/dL) 用0.1 mol/L NaOH 溶液稀释至4 mg/mL。分别取蛋白质标准液( 4 mg/mL) 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于25 mL 具塞比色试管中, 用蒸馏水补齐至1.0mL, 然后各比色管中加入4.0 mL 双缩脲试剂, 混匀, ( 37±0.2) ℃保温30 min。以空白管调零, 用751 型分光光度计在540 nm 波长, 杯径1 cm, 测定吸光值。以蛋白质含量(mg/mL) 为横坐标, 以吸光值为纵坐标作标准曲线, 如图1 所示。
3.2 饲料中蛋白质的测定
3.2.1 样品来源饲料市场采集的具代表性饲料样品10 个。
3.2.2 样品处理将样品粉碎后经40 目筛过滤, 准确称取0.2 g( 精确至0.0002 g) 饲料样品于具塞试管中, 加入10 % KOH 溶液10 mL, 沸水浴30 min, 冷却后用蒸馏水定容至25 mL, 过滤。取饲料过滤液0.5 mL, 以蒸馏水补齐至1.0 mL, 加4.0 mL 双缩脲试剂, ( 37±0.2) ℃反应30 min。以空白管调零, 在540 nm 处测定吸光值, 依据标准曲线, 求得浓度值。计算公式如下:饲料样品蛋白质含量(%) =C×2×25/W×1000。式中, C 为经标准曲线求得的浓度值(mg/mL) ;W为饲料样品重量( g) 。
4 结果与分析
4.1 不同饲料样品的对比实验结果见表1。从表1 可以看出, 双缩脲法对饲料蛋白质含量的测定结果与凯氏定氮法测定结果, 相差较大, 比凯氏定氮法所测值低15.1 %( 5.8 % ～31.7 %) 。孙建平和侯彩云( 2005) 认为双缩脲法的测定结果比凯氏法小10 % ～20 %。凯氏定氮法测得的蛋白质含量是粗蛋白质, 即含氮量乘以6.25, 其中包括无机氮和氨基酸。双缩脲法测得的蛋白质含量是真蛋白质。是碱溶液所能溶解的蛋白质, 并且与双缩脲反应转为络合物的显色部分; 而不溶解的那一部分蛋白质和双缩脲试剂的反应很少, 即使有反应, 产生的有色络合物经过滤并不存在于最终的比色液中。因此, 比色测定中读出的吸光度值, 只是可溶蛋白质形成的有色络合物的吸光度值。另外, 饲料中添加的蛋白质原料较为复杂, 有豆粕、花生粕、棉籽饼、菜籽饼、鱼粉、羽毛粉等。测定中虽经过粉碎、过筛、碱液煮沸, 但有些蛋白质仍难溶于测试液中, 与真实值相比产生较大误差。并且饲料中含有大量的粗纤维, 对于粗纤维含量较高的样品, 双缩脲法测定结果不十分稳定。
4.2 在牛奶、豆浆、牛血清中的对比实验结果见表2。从表2 可以看出, 利用双缩脲法测定牛奶、豆汁、牛血清蛋白质含量与凯氏法测定结果较为接近, 因为这些样品中所含蛋白质溶解度较高,所含蛋白质种类相对较少, 其性质与标准蛋白液接近。
4.3 双缩脲法测定饲料蛋白质含量精密度实验对5 号、6 号饲料样, 分别取6 个样品用双缩脲法测定蛋白质含量, 结果见表3。从表3 可以看出,双缩脲法对同一饲料样品的平行测定结果, 重现性较好, 精密度较高。符合国标规定蛋白质测定结果的相对偏差范围, 但平均值与凯氏法结果差距较大。
5 小结
双缩脲法测定饲料蛋白质虽然不经消化, 不产生有害气体, 但并不省时。饲料中淀粉经碱溶液及加热处理而糊化, 难以过滤, 尤其配合料淀粉含量高, 2 h 只能过滤1 ～2 mL( 浓缩料相对较快) ,且此法受工作环境( 温度等) 影响较大, 若每次作标准曲线就更费时。饲料中成分复杂, 某些离子对显色反应会产生影响, 这也是结果不稳定的原因。
综上所述, 双缩脲法不适于配合饲料和浓缩饲料蛋白质含量的测定。
