免疫细胞化学与图像分析-2
六、实例介绍
因为将免疫细胞化学方法与图像分析结合起来进行研究的论文在国内国外都还不多。在第六届国际学术会议上发表的90多篇论文中只有1篇，因此在实例介绍中，包括一部分不是免疫细胞化学方法，而是用其他组织学方法与图像分析结合起来研究，但这种方法对研究免疫细胞化学标本也可借鉴，从中可得到一些启发的，也在此选择性地作一些介绍。
Mcmillan等1983年在第六届国际体视学会议上曾报告了“用图像信息处理机客观评定免疫组织化学染色的组织”，阐明了当组织与第一抗体作用时，不断搅动血清，明显提高了免疫反应。Bordier 等1982年用图像分析法对大鼠的神经垂体进行研究，阐明了轴突占神经垂体体积的一半，分泌颗粒占轴突体积的20%，加压素的含量与分泌颗粒的体积密度无关，而与分泌颗粒内激素浓度有关。这些结果如不用图像分析法是很难得出的。Steward等1983年用测量家鸡脑单位面积内的突触数目等，来研究与记忆形成有关的细胞学改变。
英国现在有300万75岁以上的人，其中有五十万人患有老年性痴呆（Alzheimer病），这种病过去认为是由于年龄增长的不可避免的现象。英国神经科学所用图像分析仪与谷氨酸盐受体的放射自显影法结合起来对此病进行了重要的研究。由于放射自显影会产生一些非特异性的结合，用图像分析仪可以从全结合图像减去非特异性结合图像，而得到特异性结合图像，可以测出特异性结合的百分率。目前已知道，老年性痴呆患者脑中，与记忆、理性行为及感情行为有关的区域内，神经元的进行性退变，神经递质发生改变，影响了从一个神经元到另一个神经元的信息传递。
我国1991年11月出版的“计量学在形态学研究中应用学术研讨会论文集“共收集论文123篇，其中有关免疫细胞化学与计量学结合的论文共8篇：①大鼠烫伤后下丘脑室旁核和视上核内AVP含量变化的形态学计量（第二军医大学张忠义等）用图像分析仪测定AVP阳性反应物的面积。②人脊神经节 内SP、SK、CGRP免疫反应细胞的比率（中国医科大学方秀斌等），用人工计数方法。③交感神经元和胆碱能神经元中ACh和ChAT显示比较（军事医学科学院汪家政等），用图像分析法测定各种参数。④大鼠脾树状突细胞的组织分布棗S—100蛋白标记和立体计量分析（南京铁道医学院张锦堃等）用目镜标线片的测格进行定量研究。⑤垂体GH腺瘤细胞分泌颗粒的免疫胶体金定位检测及定量分析（中国人民解放军总医院罗毅等），用图像分析法测定各种参数。⑥胃肠粘膜重度异型增生与腺癌细胞核DNA含量的测定及免疫组化的比较研究（上海第二医科大学吴平平等），用显微分光光度系统进行DNA测量。⑦免疫组化在胃癌病理棗生物学分型中的价值（滨州医学院张树毕等），将免疫组化反应分为阳性阴性而进行比较。⑧人胎十二指肠EC细胞的体视学研究（江西医学院朱清仙等）用目镜标线片测格进行定量研究。由此可大致体现我国在此领域的研究现状。
七、图像分析与体视学
图像分析还可用于三维重建，用连续切片可重建立体的原形，在神经组织的研究中很适用。我们在显微镜下观察到的是平面图像，而这些平面图像是从立体结构中切下来的，单凭平面图像不能反映组织的真实结构，例如圆形可以从球形、圆柱形、椭圆形物体中切下。如何从二维结构推导出三维结构，这就是所谓体视学（stereology）所研究的范畴。stereology 这个词是1961年开始正式应用的，由于体视学与图像分析的密切关系，无论是国际上的或国内的学术会议都将这二者放在一起讨论。
将体视学知识与免疫细胞化学标本观察联系起来，将是一种可以获取更多信息的研究手段，目前国外已很重视体视学的研究方法，发表了一些论文，国内也开始做这方面的工作，因此有必要将体视学的一些基本术语介绍给读者，供参阅文献时或自己进行研究时应用。体视学语言目前已是一种通用的术语，现将常用的介绍如下：
结构（structure）：在一个确定的组织模式中，由许多相互依赖的部分所组成的某物体称为结构。一个结构至少有二个组分构成，体视学的目的即弄清楚各组分之间相互关联程度、相对大小等。
组分（component）：在结构中能被截然分开而且能被辨认的部分。
相（phase）：所有在本质上相同的组分的集合称为相。例如一个细胞的所有线粒体构成了此细胞的线粒体相。
粒子（partiele）：假如组分是由许多离散的并且能够作为单元独立存在的要素所组成，则将这些要素称为粒子，粒子可以表现为各种形状。
凸面体（convex solid）：连接此实体内任何两点的线段，必需全部落于此实体内，换句话说，即此实体上切下的一个切片只能形成一个截面。
包容空间（containing space）：指包含被研究的组分的空间。当然，被研究的组分常与其他不被研究的组分并存。
密度（density）：单位体积、单位面积或单位长度内的量。
体积密度（volume density）：在单位包容空间内，某相的体积。
表面积密度（surface density）：单位包容空间内所含有某相的表面积。
长度密度（length density）：单位包容空间内某相的长度。
数密度(numerical density)：单位包容空间内某相的数目。
截面（profile）：任何结构的切片上的图像。
体视学的测量值往往是相对测量值，以两个彼此相关联的测量值的比率来表达，其中一个测量值与组分有关，另一个测量值与包容空间在关，后者也称为“参考系统”。体视学原理可确定在切片上测得的这些比率与空间结构内相应的比率之间的精确关系。上述性质反映在体视学符号中，而这些符号目前已普遍被使用，在有些文献中已不再作解释了。常用的符号如下：
P测试点数
P1单位测试线长上的交点数
Pa单位测试面积上的点数
Pv单位测试体积上的点数
L测试线长
L1单位测试线长上的截距
La单位测试面积上线的单元长
Lv单位测试体积上线的单元长
A测试面积
S表面积
Aa单位测试面积上被测物的面积
Sv单位测试体积内被测物的表面积
V体积
Vv单位测试体积内被测物的体积
N被测物数目
N1 单位测试线长上与被测物相交的数
NA单位测试线长上与被测物的数
Nv单位测试体积内被测物的数
用测试网格的体视学方法，杨光等，1987年曾对腹腔神经节 小强荧光细胞进行超微结构的定量分析，测量了线粒体、溶酶体、粗面内质网、颗粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等参数，得出了标准小强荧光细胞的计量值。此处的Vv即单位体积细胞质内某种细胞器的体积，据体视学原理，Vv等于切片上被测的某种细胞器所占的面积的均数a与细胞质的面积的均数A之比，如用图像分析仪即可得出此二者的面积，而用测试格a等于落在此细胞器上的测试格的交点总数∑Pi，A等于落在细胞质上的测试格交点总数∑Pc。
Vv=ā／A=∑Pi/∑Pc
测试格的交点数有各种规格，如果有20条横测试线与20条纵测试线组成的测试网格，则有400个交点，利用交点所落部位进行推算。
免疫组织化学形态计量研究中参照空间的“陷井”问题。在某种组织结构（参照空间）内测量特征物的密度值（如体积分数、表面积密度、长度密度、数目密度等），如果不知道参照空间的体积，得不到绝对值，就有可能作出错误的结论，就是参照空间的“陷井”。举一例子说明：实验的结果苯巴比妥对大鼠肝细胞中的内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，如果依此就认为苯巴妥对肝细胞（参照空间）内质网无显著影响，就错了，就进入了参照空间的“陷井”中去了。实际上，在些实验条件下，肝细胞质总体积显著增加，因而虽然内质网的体积分数和表面积密度无显著差异，但其绝对值已显著增加了。因此，要测量或估计参照空间的体积、乘以密度值，获得绝对值，才能获正确的结论。
八、国内外生产图像分析仪的情况简介
（一）国内情况
80年代初，以IBM—PC为代表的个人计算机得到了突飞猛进的大发展和在普及；紧接着各种功能强大面向图像处理与分析的专用超大规模（VLSI）蕊片或单板达到商品化水平，两者的结合，为微机图像处理系统的问世奠定了硬件基础。打破了以往只能在大中型计算机加专用图像处理系统的构成价格昂贵的图像处理系统的局面。为推广图像处理与分析技术创造了物质基础。从80年代中期开始，国内先后有武汉大学、清华大学、中科院自动化所、计算所、重庆大学、四川大学、华北计算所等单位，纷纷进行微机图像处理与分析系统的研制和推广应用工作。其中以四川大学计算机系图像图形研究所研制开发并定型生产的MIAS系列图像分析仪在国内具有较大的优势，获得了1992年国家级新产品证书。
现介绍如下：MIAS系列图像分析仪包括伪彩色型MIAS—300，真彩色型MIAS—400，超高分辨率型MIAS—1000等面向生物医学、金相分析、石油地质以及其它专用目的的各种图像仪均由硬件系统和软件系统两大部分构成。硬件系统主要包括MIAS图像处理计算机、图像输入设备，图像输出设备和交互式处理设备等。其主要性能指标：图像分辨率512×512，640×480，1280×1024。图像采集速度：电视方式0.04s/帧，慢速高精方式2～10秒/帧。图像存储体：MIAS—3000.5MB～1.5MB（兆字节 ），MIAS—4001.5MB～4.5MB,MIAS—1000 2MB～10MB 。灰度等级：256或4096。专用图像处理器特性：IPU40MHZ主频，>10MIPS。IFU（图像浮点处理器）40MHZ主频，>4MFOPS（每秒兆浮点处理指令）。在各种图像输入设备中，以视频摄像机为图像的基本输入设备，也可以配接视频录像机、数字扫描仪和连接扫描电镜的专用接口。高分辩彩色监示器为图像的基本输出设备。该系统还具备有自动移位的载物台和自动聚集控制系统可供用户选择。MIAS系列图像分析仪的软件系统是在DOS（磁盘操作系统）3.2以上环境开发的，全部采用C语言和汇编语言（80286宏汇编，TMS340系列专用汇编）进行编程，共98个功能模块。主要功能包括初始化及环境设置、图像输入和输出、图像编辑、图像增强、图像分割、图像测量、实用程序等。测量参数包括一维和二维目标的各种形态参数，灰度参数和纹理参数等数十种。该系统在长期为华西医科大学、第一和第四军医大学、北京军事医学科学院、上海医科大学、湖南医学院、哈尔滨医科大学等数十个医学单位的服务中，积累了许多有效的实用算法和功能、用户界面和处理速度方面已达到和超过某些进口中高档图像仪的水平。
（二）国外情况
英国的主要生产厂家有剑桥仪器公司（Cambridge Instruments Company），在图像的测量、计算、比较、分类等功能上都比过去的产品更完善，使用了大功率的新型计算机，使用QUIPS程序可获得各种图像分析测量的数据，重现性好。操作者不必精通程序设计语言，只需接受几小时使用QUIPS语言的教学训练即可。
英国Ealing—Beck公司生产Histotrak图像分析系统，如用透射光，该仪器能自动改变放大倍数。具有阴影校正系统。最使研究工作者感兴趣的是该仪器中设有坐标发生器，能使被检图像的坐标数据通过台式计算机在输出打印机上打印出来。
英国Micro Measurements 公司生产电视扫描图像分析仪，成本较低，用途较多。
英国Joycez—Loebl公司生产Magiscam图像分析系统，操作较简单，可解决一般图像分析问题，并可进行彩色图像分析，在医学和放射学等方面适用。
美国的主要厂家有美国美敦设备公司（Milton Roy Company），生产OMNICON图像分析仪，据上海多国仪器仪表展览会资料介绍，Ommicon图像分析系统有Omnicon Alpha500用于常规检验和研究。Ommicon FAS—III 用于医学和生物学领域较合适。Omnicon 3500为一种多用途的系统，配有64K通用NOVA4×计算机。Omnicon 5000是该公司发展的使用起来最方便的定量图像分析仪。Omnicon 7500是为了对图像作实时分析而设计的产品。
德国Leitz公司制造Leitz T.A.S图像分析仪，图像输入装置是一台Leitz Orthplan显微镜，该仪器还包括一台TU—58双盒式磁带机，可用于存贮程序、数据、图像。该公司产品的新型号是Leitz T.A.S PLUS，增加了自动调焦、自动图像旋转等功能。
德国Carl Zeiss公司的产品是Micro—Videomat，主要优点是有适用于计算机和大型计算机的程序。型号有Micro Videomat 2型、3型等。
德国的OPTON公司生产IBAS2000图像分析系统，可应用于显微图像分析的所有领域，如放射自显影、染色体分析、真色图像信息、细胞学分析、用连续切片来重建原形、颗粒大小分析、纤维分析、可测定交叉的或重叠的纤维长度及纤维的长/宽比例等。
德国VEB Zeiss Jena公司生产EPIQUANT图像分析仪，可进行自动或半自动分析。
日本浜板电视公司生产一系列特殊用途的、测量特殊参数的自动分析系统，如其中有一种称为Multianalyser的，与显微镜相结合，可用来测面积、长度等。
对国内外资料收集比较局限，总之购置仪器时要充分了解性能、对价格作比较、才能获得满意的结果。
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