纳米孔测序重大升级，超高准确度，向临床诊断迈进！
近年来，第三代基因测序技术发展迅速，在基因组学研究以及临床疾病诊断领域备受青睐。该领域上游企业英国Oxford Nanopore Technologies（以下简称“ONT”）因其测序技术在样本处理以及成本等方面占据较大优势，而受到国内基因测序服务企业的钟爱。相较于二代测序，三代测序技术拥有单分子无需扩增、长读长等关键优势，但其测序数据的准确性一直是相关应用的一大劣势。为了克服这一劣势，ONT纳米孔测序技术不断升级和改进。而就在上周，该公司发布了新型R10芯片，可以称得上是一次重大的技术升级，极大程度上解决了三代测序数据准确性的问题。
图1：新型R10芯片纳米孔示意图
据悉，新型R10芯片最大的更新是纳米孔采用了双读取器（Reader）的设计。这使得R10芯片能够对同一碱基进行两次信号识别，测序准确度因此得到极大提升！相较于当前广泛使用的R9.4.1版本芯片，R10芯片理论上对同一碱基的识别次数为R9.4.1芯片的2倍，因此可提供相当的读长、产量及更准确的数据，且测序芯片的成本保持不变。
从R10芯片的内测结果来看，非常令人欣喜。在小型基因组样本上，R10纳米孔的共有序列准确度已达到Q50的水平——相当于每10万个碱基中有1个错误，或99.999％的准确度。目前，该新型纳米孔芯片已从内部测试使用过渡到早期试用阶段，面向少数用户进行开放测试。国内多家企业均已引入了该芯片系统。
那么，该系统在实际临床应用中的表现如何？
今日，北京希望组生物科技有限公司（以下简称“希望组”）发布了基于Nanopore R10芯片系统对临床上的一种罕见病，杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, 简称DMD)，阳性样品的实地测试结果。接下来让我们一睹为快。
图2. 具有新型纳米孔的R10芯片
据悉，希望组本次实验中共测试了两张R10芯片，分别检测了1个人类DNA标准样本，及2个加了barcode的DMD阳性参考品混合样本。其中，两个阳性参考品分别为1个点突变及1个缺失突变。测试采用完全相同的实验方法对这两个样本的2.2 Mb DMD基因全长区域进行富集，然后分别上机测序。
为了充分测试R10对于准确度的提升，在本次评测过程中，希望组团队采用了实时高准确度（High-Accuracy）模式进行测序。实时测序结果显示，测序仅开始半小时后，单张芯片产出已达到230Mb，对于单个DNA标准样本来说，相当于DMD基因全长100X的覆盖深度，已经满足后续分析的测序数据量。而当测序继续运行至约16小时后，两张芯片则分别产生3.3 Gb和3.9 Gb数据，远远超出单个样本所需数据量，这就为后续临床样本的检测提供了更多策略上的可能性。
R10实测下机数据展示
通过对测序数据的初步质控，R10芯片在read质量方面的表现令人惊艳不已：pass reads提供了平均超过20的质量值（Qscore），而mapping后的reads准确度更是多数分布在95%以上！
图3. R10实测数据Pass read质量分布图
利用高质量R10数据检测DMD突变
杜氏肌营养不良（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）是一种常见的遗传性神经肌肉疾病，具有X连锁的隐性遗传模式。DMD基因全长2.2Mb位于X染色体上，是人类基因组中最大的基因之一，具有79个外显子，其突变类型主要包括：大片段的缺失或重复、微小突变（包括碱基的置换、重复、缺失或插入）和剪切区突变。由于DMD基因中有超过60%的突变均为大片段SV，为三代长读长测序的天然优势“战场”，那么接下来就一起来看看高质量R10数据在检测DMD变异方面的能力吧！
希望组团队对pass reads数据进行拆分，采用clairvoyante软件默认参数，在其中一个DMD阳性参考品中，成功检出一个C>T单碱基突变位点，排除掉少量由于拆分错误导致的reads错误比对，突变频率接近100%（图4）。
图4. 检测到的SNV示意图
而对另外一个DMD阳性参考品采用sniffles软件默认参数进行比对时发现，在X染色体p21.1区段可以成功检测到一个26Kb的大片段deletion（图5）突变频率也接近100%，与参考基因组比对后可以清晰地看到reads的两个断点区域（图6）。
以上这两个结果都与预期相符。
图5 . 大片段deletion示意图
图6. 与参考基因组比对read断点示意图
从实测数据来看，Nanopore R10芯片不仅保持了ONT在大片段SV上的检测优势，同时在单碱基致病变异检测方面也展现出强大的潜力，在read准确度方面表现抢眼，一改之前大家对于三代测序单碱基质量差的印象，使得ONT在向临床诊断方向的应用又迈进了一大步。
基于Nanopore R10芯片最新实测数据，希望组CEO汪德鹏表示：“三代测序在解决单碱基准确度问题方面一直是个难点。希望组一直致力于突破技术的极限，从本次实测数据来看，高质量R10数据在检测DMD阳性样本SNP和SV方面实现了革命性的突破，极大地提高了单碱基准确度。我们现在只是初步的测试，后续还会继续加大样本量，持续不断地在推动三代测序精准诊断领域不断努力！”
相信，随着更多企业实测数据的发布，未来三代测序必将带来更多亮眼的表现。我们也共同期待三代测序技术未来在遗传病、肿瘤、辅助生殖、病原微生物检测等疾病领域的取得更多的突破性进展。
