DGGE技术在微生物生态学中的应用
在自然界中存在大量丰富的微生物资源，但目前被人们所培养利用的仅仅占1%～10%，还有大量的微生物没有被人们所了解和利用。随着基因组学在生物技术领域的不断发展，微生物基因组学的研究凭借基因组研究(TIGR)所利用鸟枪法成功地对流感嗜血菌(Haem ophilus influenzae)的全基因组序列的测定而日趋发展起来。特别通过将分子生物学的研究方法与微生物学的研究相结合，使得人们在微生物的进化、结构以及基因组等方面取得了一系列重要的研究成果，从而使大量未培养的微生物的利用变为可能，其中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术在对微生物多样性的研究中应用广泛，目前DGGE已被应用于分析自然环境中细菌、古菌、真核生物、微型真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息且同时分析多个样品，具有可重复和容易操作等特点。适合于调查种群的时空变化，并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析来鉴定群落成员。
1 DGGE的基本原理
DGGE技术主要原理如图1所示，在碱基序列存在差异的DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，他们一旦解链，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳行为将发生很大的变化。因此，将PCR扩增得到的等长DNA片段在含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳的速度急剧下降，以至停留在相应变性剂梯度凝胶中，染色后在凝胶上呈现为分开的条带，每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA序列。该技术可以分辨具有相同大小片段的序列差异，可以用于检测单一碱基的变化，微生物群落遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。
为了提高DGGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5′端设计增加一段富含GC的区域( GC-Clamp，其长度通常为30～50个核苷酸) ，避免了DNA的完全解链，从而提高了不同碱基的检出率，使相差一个碱基的序列也能分辨分离。
2 技术步骤
该技术主要操作过程如下：(1)样品总DNA提取;(2)样品16SrDNA片段的PCR扩增;(3)DGGE条件优化与分析;(4)割胶测序等后续处理。
3 DGGE 的应用前景
自Handelsman 等1998 年提出元基因组学(环境基因组，Metagenomics)后，利用现代基因组技术进行自然或人工环境的微生物群落的研究成为热门方向。目前，元基因组学手段已经被应用于海洋和土壤微生物群落的研究。来源于环境中未培养微生物的功能基因甚至是基因组学研究拓宽了微生物群落的研究领域。DGGE 技术可以监测复杂环境中特异的功能基因及其表达研究,为元基因组学研究提供有利信息和基因筛选方案。此外DGGE 分析中获得的核酸序列还可以进一步应用于荧光原位杂交、DNA 芯片和实时定量PCR (Real-time PCR) 等技术，为特异种群的快速检测做出贡献。
目前DGGE 在环境微生物学中是一种被普遍接受的进行微生物群落复杂性和行为研究的分子生物学工具。该技术具有可靠、可重复、快速和容易操作等特点。结合PCR 扩增标记基因或其转录物(rRNA 和mRNA)的DGGE 能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析使之非常适合调查微生物群落的时空变化, 而且可能通过序列分析切下的带或通过与独特的探针杂交鉴定群落成员。加之对这种技术作用的理论背景有很好的了解, 如双链DNA 在溶液中的解链行为的热动力学原理。使用DGGE 可以了解环境被干扰后微生物群落或某种指示微生物的命运。功能基因作为分子标记的常规使用能够用来鉴别密切相关但生态上不同的种群。末端标记的荧光PCR 产物和(区内(intra-lane) 标准可用于检测稀少群落成员和
尽管DGGE 电泳技术在研究群落动态和多样性方面存在很多优势，但是该技术无法给出代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。因此必须与其它技术相结合才能弥补不足。Biolog和酶学分析均可以提供群落代谢活性特征。此外荧光原位杂交技术可以提供细菌的相对数量信息，稳定同位素探针的原位杂交技术，可以提供代谢信息，得到群落结构和功能关系。通过16S rDNA或基因文库也是分析不同种群的相对数量的一种方法。利用Real-time PCR 扩增特异种属的16S rRNA或功能基因，可以对群落的细菌数量和基因表达水平进行定量。因此，与其他分子生物学技术的结合后，可以进一步发挥DGGE 技术的效能，更好的为微生物群落结构和功能分析服务。
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