标准曲线响应因子计算
1.概述
1.1.相对响应因子(Relative response factor，RRF)的概念
RRF一般应用于原料药或者药物制剂色谱分析方法中，对有关物质(如杂质或者降解杂质)的精确定量或者活性药物原料(API)的纯度检查。用于校正不同化合物在不同的分析方法中检测器信号响应的差异，一般为各种杂质对于API的相对信号响应，各国药典(包括USP，EP，BP等)对其表述大同小异，可简单描述为：单位质量(质量浓度)的杂质与API的检测信号响应之比(RFimp/RFapi)。
1.2.影响RRF的因素
影响RRF的因素有很多，其中包括化合物本身的性质也包括分析方法条件的设置，以配置PDA检测器的HPLC分析方法为例，将RRF影响因素列于下表1中(不限于)。
HPLC以及GC是制药行业应用最多的分析仪器，其配置的各种检测器包括通用型检测器以及一些化合物特异性检测器，如GC通用型FID检测器对几乎所有有机化合物均有较好的响应，ECD，FPD检测器则是检测谱相对比较窄的化合物特异检测器；HPLC通常配置的PDA，ELSD，CAD，MSD检测器均为通用型检测器，CLND作为一款化合物特异性检测器则不常用。不同的化合物在不同的检测器下往往具有不同的响应因子(RF，如PDA检测器的不同检测波长下RRF有可能差异很大)，在使用色谱积分面积百分比考察样品纯度时，就需要以API的RF为基准对相关杂质的RFs做校正，保证样品纯度测试结果的准确可信。
除上述所列的分析条件的改变会影响RRF之外，其他任何常见的方法的改变亦会影响RRF。在使用PDA作为检测器，其他分析条件既定的情况下，波长的选择对于RRF的影响是绝对影响因素，不同的化合物具有不同的紫外吸收光谱(无共轭作用化合物一般无紫外吸收)，因此在不同的检测波长下，RRF测定值有所区别(以下RRF均以PDA作为HPLC检测器)。
1.3.RRF的应用范围
RRF在不同目的的分析方法中均有广泛的应用，如In-Process-Control，纯度检测，Mass balance调查，杂质限度测试与制定以及Stability/Impurity indicating(按照ICH Q3B R2要求，RRF在0.8-1.2)等。
在API工艺研发过程中，In-Process-Control分析方法(HPLC)需要对反应过程进行监测与控制并以原料的转化率或剩余量设定合适的反应终点，在对色谱图处理时一般采取面积归化法判断反应是否到达终点。如果原料与产物之间RRF超出范围(0.8-1.2，就需要对其进行RF校正之后再以面积归一化法，报告检测结果。
在纯度以及Stability/Impurity indicating测试时，更应该对相关杂质或相关降解杂质的RRF进行测试。尤其是在Stability/Impurity indicating测试时，各种降解条件（参照ICH Q series）产生的相关降解杂质UV谱有可能保持相对一致（分子母核保持不变，活性基团降解，交换等），也有可能差异较大或者吸收很弱甚至在该检测波长下无明显的紫外吸收（如含氮、硫杂环开环等）；此时，若不对RF进行校正，则极易引入Mass balance问题。在对RF不一致导致的Mass balance问题进行调查时，与UV联用ELSD或者CAD检测器一般会有助于发现该问题（下图1A以及1B）。
此外，杂质限度测试与制定亦需要对其RRF进行测试，以此对其绝对含量进行校正。
2.RRF测定方法
RRF的测定方法有很多，包括以PDA作为检测器直接测定，也有间接测定方法，实际测定时需要根据具体条件以及资源可利用情况，灵活做出选择。
2.1RRF直接测定法
PDA检测器作为一款浓度型通用型检测器，具有最宽泛的应用范围。其信号响应与化合物的浓度呈直接线性相关，其基本构造如下图2所示。
依据RRF被广泛接受的定义，利用RRF=(Response Areaimp/Concentrationimp)/(Response Areaapi/Concentrationapi)可对其以PDA作为检测器进行直接测定。直接测定需要得到对照品级别的相关物质或杂质以及API，具体有以下几种方法：
（1）单浓度点法，准备已知浓度的特定物质/杂质对照品和API溶液，可分别进样也可作为混合溶液HPLC进样，按照上式计算RRF。
（2）多浓度点法，准备高、中、低浓度的特定物质/杂质对照品和API对照品溶液（注意样品浓度不能超载），HPLC进样并计算RRF，以平均值作为最终RRF。
（3）标准曲线法，分别制备0.1%-1.0%的系列浓度溶液（涵盖定量限），得到相应的标准曲线，曲线斜率之比即为RRF。
（4）吸收系数法：PDA作为检测器时，RRF为相关物质于检测波长处的紫外吸收系数之比，可按照A=lg(1/T)=Kbc分别计算K，摩尔吸光系数，之后以各自相对分子质量校正之后相比得到RRF。
从上述表述中亦可以看出直接法测定相关物质/杂质的RRF，均需要得到对照品级别或者已知重量含量的相关物质/杂质，很多时候并不能到达该要求。如Stability/Impurity indicating测试时，不可能事先准备相关降解杂质，尽管在杂质之后得到这些降解杂质的Impurity profile并利用Q-TOF得到相关杂质的精确分子量或者花费大量资源明确其结构，进而对其进行合成亦需要自此花费大量的人力以及物力（不具备制备需要的量）。而有时，纵然花费了大量的人力、物力，短时间内也不一定能够对其进行合成以及纯化。
2.2 RRF间接测定法
间接测定法主要是指将UV-PDA检测器与其他浓度相关型检测器如CAD，ELSD，CLND，MSD等进行串联（串联方式如下图3所示），进而对RRF进行测定。
CAD（charged aerosol detector，电喷雾检测器）作为另外一款通用型HPLC检测器具有灵敏度高，不同化合物的响应一致（表2），重现性好，检测范围较宽且信号响应不依赖与化合物本身的共轭性质等特点，但受流动相的组成变化影响较大，其简单工作原理如下图4所示。
在较宽浓度范围内，CAD检测器的信号响应与样品浓度并不呈直接线性相关，而具有Y=aXb的关系（Y，色谱积分面积；X，样品浓度），但在较窄的浓度范围内（0.1%-1.0%）则呈现较好的直接线性相关。此外，CAD对于结构相关化合物表现出信号响应的高度一致性，特别适合于Stability/Impurity indicating样品进行分析。
在以UV-CAD串联的方式对RRF进行测定时，可按照下式进行计算
在以Gradient方式对样品进行分析时，为消除梯度变化对于RRF的影响，可在样品中添加已知浓度的已知杂质作为内标对计算方式进行校正，或者使用双梯度（图5A与5B）对RRF进行校正。
下图6为典型Stability/Impurity indicating样品利用UV-CAD对相关降解杂质进行分析并测定RRF的色谱图，其中图6A为已知结构以及浓度的9个相关物质（内标）的UV-CAD图谱，图6B为降解样品UV-CAD图谱。
其中Photodegradant杂质为光降解杂质，为加入的内标之一，以直接测定法得到的RRF与UV-CAD法测得的RRF进行比较，表3，可以看出两种测定方式保持了高度一致性。
ELSD（charged aerosol detector，电喷雾检测器）作为与CAD类似的检测器，同样可以UV-ELSD的方式对相关物质/杂质的RRF进行测试。与CAD类似，信号响应与样品浓度并不呈直接线性相关，而具有Y=aXb的关系，但在较窄的浓度范围内（0.1%-1.0%）则呈现较好的直接线性相关，RRF计算方式可参照CAD检测器。
其检测性能上要稍逊与CAD检测器，具有与CAD检测器一样的缺点，即RF对流动相的组成变化比较敏感，但可以以同样的方式克服，其基本检测原理如下图7所示。
与CAD检测器类似地，样品从色谱柱流出之后经过雾化，蒸发，检测三步。下图8为将HPLC-UV-ELSD应用于某一API在酸性环境下降解样品的分析以及相关杂质RRF的测定。
该实例分别测试了50 ug/mL以及125 ug/mL浓度的API中的相关降解杂质的RRF，如下表4所示。
上述数据说明UV-ELSD的方式可以对相关杂质的RRF进行简单测定，且在228 nm的检测波长下，降解杂质B的RRF超过0.8-1.2的范围，需要对分析方法的检测波长进一步优化选择。
一般地，MSD检测器不能以与UV-PDA检测器联用的方式测定相关物质/杂质的RRF，这是因为不同的化合物其离子化能力不一样，导致信号响应与化合物的浓度之间很难建立起一定的数学模型。但其可以结合CLND检测器(Chemiluminescent Nitrogen-specific Detector，氮化学发光检测器)一起与UV-PDA联用对RRF进行测定(CLND工作原理简图如图9A，氮化学发光原理如图9B)。
该检测器的信号响应与样品分子的氮含量呈线性关系，检测限度可达ng氮级别(如图10)，但改检测器只对含氮化合物具有响应(但不能含有N=N以及N-N结构)，流动相不能使用乙腈以及含氮添加剂。
以CLND检测器串联UV-PDA检测器测定相关物质/杂质的RRF，往往需要知道该物质/杂质的精确分子量进而计算其分子式，确定其含有几个氮原子。RRF的计算可按照下式进行。
其典型应用图谱如下图11所示，测定结果见下表5。
3. 结论
RRF作为重要的色谱方法学参数，其值取决于化合物本身的紫外吸收光谱性质以及所用PDA检测器的波长，测定准确的RRF值对于相关物质/杂质研究非常重要。直接法测定简单，易于操作，但往往需要得到已知重量含量的较纯样品，因此寻找其他可替代间接方法对RRF进行测定具有比较现实的意义。以HPLC-UV串联CAD，ELSD或者CLND检测器的方式对RRF进行测定，可不用获得较纯样品，实现在线测定。在实际应用中，可根据需要以及资源可支配情况，进行灵活选择。
