Raf 蛋白 Ras 结合结构域的简并进化库合成以及利...（一）
Raf 蛋白 Ras 结合结构域的简并进化库合成以及利用片段互补法快速筛选二氢叶酸还原酶的快速折叠且稳定的克隆实验
实验材料 寡核苷酸引物Tag 聚合酶BL21 电转感受态细胞
试剂、试剂盒 氨苄青霉素卡那霉素
仪器、耗材 琼脂糖凝胶
实验步骤
3.1 概论
3.1.1 PCA 对空间排列的要求
PCA 片段的三维朝向对于 PCA 报告蛋白是否能正确折叠至关重要，它取决于形成复合体的目的蛋白 N 端或 C 端的朝向（图 15.1 示意了在连接设计中对空间位置的考虑）。因此，在设计蛋白一PCA 片段融合体时，以何种方式将蛋白质片段连接在一起使其能够折叠形成天然结构是非常重要的。融合蛋白能否正确折叠受融合蛋白的末端朝向和片段间接头（linker) 长度两个因素的影响。我们将片段 GGGGS 应用于多种不同蛋白质，证明这个序列在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统中效果都比较好。我们认为这个序列可以改善融合蛋白的弹性和可溶性，从而有利于其组装，而且由于此序列中不含天然蛋白酶识别位点，确保了融合蛋白的稳定性。虽然此类的接头受到青睐，但并不表示使用它就一定能得到可以互补的片段 [ 31，32，39] 。然而，还是要避免使用诸如脯氨酸和分支氨基酸类的大的疏水和刚性氨基酸。在大多数蛋白质工程的问题中，形成复合体的目的蛋白的三维结构是已知的，因此可以设计复合体的方向并计算出所需接头的长度。对于 DHFR PCA 来说，融合蛋白 N 端和 C 端的空间构象需求是已知的 [ 31，44 ] 。例如，如果将目的蛋白分别与F[ 1 ，2 ] 的 C 端和 F[ 3 ] 的 N 端融合，那么构建时所需的接头就可以很短甚至不需要，因为这种构建方法已经考虑到了 DHFR 的拓扑结构；但是如果将目的蛋白分别构建到两个片段的 N 端，要使 DNFR 能正确组装，就必须在两个融合蛋白之间插入至少两个氨基酸作为接头（每个肽键大约 3.75 A ) ，因为 DNFR 两个片段 N 端的距离将近 10A。在 ras 和 RBD 的例子中就选择了这种构建方式。然而，观察 raf RBD 与 ras 髙类似蛋白 raplA 的复合体结构发现这两个蛋白质的 C 端距离 40A，这就需要在每个融合蛋白中插入至少 6 个氨基酸的接头。对于文库筛选来说，我们将每个接头的总长度定为 14 个氨基酸，其中包括限制性内切核酸酶位点，以确保融合蛋白具有足够的灵活性。
3.1.2 对照和严密性
在利用 DHFR PCA 进行蛋白质工程研究和文库筛选之前，必须做严格的对照实验用以估计其对特定的测试系统的灵敏度和严密性。理想条件下，在进行文库筛选前，实验者应大概了解 PCA 对于一个给定的相互作用体的解离常数 Kd 的极限。不同的相互作用蛋白对有着不同的灵敏度极限（PCA 可以检测到的最大 Kd )，但是 Kd 值又受到融合蛋白表达水平、蛋白质表达总量中可溶蛋白比例以及诸如稳定性、可溶性和蛋白质折叠、结合参数等蛋白质自身性质的影响。如果 PCA 十分灵敏，可以检测到两个特定蛋白质间非常弱的相互作用，它就不能在众多的克隆中选出最好的相互作用蛋白对；也就是说，此项实验过于灵敏从而丧失了严密性。因此，平衡灵敏度和严密性的关系至关重要。为了解决这一问题，在 PCA 实验前通常需要做些对照实验，虽然不是所有的这些对照都与特定的蛋白质工程研究相关，我们在后面还会再讨论这个问题。
( 1 ) 伪组装（spurious reassembly): 要使 PCA 能有效工作，应避免片段间微弱的或非特异性的相互作用。对于一个给定的相互作用蛋白对测试系统来说，PCA 有效的灵敏度可以通过对照 4 和 6 来估算。如果灵敏度过高，如长出不该有相互作用的蛋白对的菌落（图 15.2A ) ，可以通过降低表达水平或通过对照 2 中所述的严密性突变来降低灵敏度（图 15.2B)。
( 2 ) 严密性突变（stringency mutant)：突变 DHFR 两片段相互作用表面上的氨基酸残基侧链的效果，如已报道的 F[ 3 ] 的 I114A 突变。在克隆表达通过形成亮氨酸拉链 ( leucin zipper) 而相互作用的蛋白对时，菌落生长速度和数量无法区分不同蛋白对间的结合效率。后来，在 F[ 3 ] 中引入突变 I114A，改变了 PCA 的灵敏度，使其可以应用于亮氨酸拉链系统。这种灵敏度的变化可以通过一步筛选的选择因子（selection factor) 来衡量，选择因子等于共转化细胞数除以在选择压力下存活菌落数。数值越高严密性越高，所以在合理数量的重复竞争下，可以挑选出最好的相互作用亮氨酸拉链异源二聚体 [32]。
( 3 ) 片段置换（fragment sw apping)：无论将相互作用的两个蛋白质分别与 PCA 系统的哪个片段融合，理论上应不影响两个目的蛋白的相互作用。因此，置换与两个目的蛋白质融合的片段应得到类似可比的结果。
( 4 ) 无相互作用蛋白质（noninteracting protein) : 如果已知一个蛋白质不和任何一个用于 PCA 测试的目的蛋白有相互作用，理应检测不到 PCA 反应（图 15.2A ) ，并且单独过量表达这个蛋白质也不会对已知的相互作用有竞争影响。
( 5 ) 通过竞争实验滴定和降低报告蛋白的酶活：报告蛋白的活性应随着两个融合蛋白表达比例的变化而改变；而且同时单独过量表达相互作用蛋白的其中之一应减弱 PCA 反应的活性。然而，应谨记每个融合蛋白相应的可溶性和稳定性、相互作用蛋白质间的亲和力对比它们的胞内浓度以及 PCA 的灵敏度都会对 titrate 报告蛋白的活性造成影响。因而可以通过降低融合蛋白的表达水平或整合对照 2 和对照 6 来调节报告蛋白的活性，从而降低互补效率。
( 6 ) 破坏相互作用：可以预测，在形成复合体的一个单体中插入特定的点突变或删除突变破坏或减弱目的蛋白相互作用力也会影响 PCA 反应。
如果蛋白质工程项目中用于研究的模型性质已经相当清楚，那么只有对照 1、对照 2、对照 4 和对照 6 对于确定实验的特异性和准确性是必需的。RBD-ras 的互补突变实验及突变对亲和常数 Kd 的影响已有相关报道，基于这些数据我们构建了若干突变，使 RBD-ras 相互作用的 Kd 值降低了三个数量级（图 15.3 例子）。我们将这些突变体和其他突变体都用于 DHFR-PCA 测试，以确保这项实验可以在 1 μmol/L 的数量级上检测到 RBD 与 ras 的相互作用。另外，已发表的降低蛋白质稳定性的突变，如将核心区疏水氨基酸残基（Val、Leu 或 lle ) 突变成 Ala，可以用于严密性测试。
3.2 合成文库
( 1 ) 为了得到一个无偏倚的文库，首先要构建一个模板，用终止密码子替换基因插入区（可变区），同时插入移码（frame shift ) 和特定的限制性内切核酸酶位点以确保其明确鉴定（见注 1)。
( 2 ) 要得到每个文库，需要两个部分重叠（一般 18~20 bp) 的 PCR 产物。例如，对于 PCR 反应 1，使用的一条引物与载体的启动子区域（起始密码子上游 120 bp，图 15.4) 杂交互补，另一条引物与简并靶标的 5' 段互补。对于 PCR 反应 2，需要一条双臂引物和一条与 F[ 1，2] ( 可读框 3' 下游 120 bp 处，图 15.4) 杂交的引物。通常，PCR 反应程序设置如下：94°C 热起 1 min；然后，94°C 30s，52°C 30s，72°C 30s ( 见注 2)，共 25 个循环；最后，72°C 延伸 10 min 以确保延伸完全。
( 3 ) PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用 Gelstar 和 Dark reader（见注 3 ) 观察琼脂糖凝胶上的 PCR 产物，这里使用的是 400~500 nm 的蓝光，此波长对 DNA 没有损伤。如果得到目的条带，将剩余的 PCR 产物用于切胶回收。
( 4 ) 使用 QiaexTMII 纯化切胶产物（见注 4 )。
( 5 ) 将来源于 PCR 反应 1 和 2 的产物约 300 ng 混合（图 15.4 和注 5)，加入 0.2 μmol/L 的末端引物（分别与启动子区和 F [ 1，2 ] 互补）分别与 PCR 反应 1 和 2 的 5' 端和 3' 端退火。PCR 反应 3 程序如下：94°C 热起 1 min；然后，94°C 20s，52°C 30s，72°C 30s，共 10 个循环；最后，72°C 延伸 10 min 以确保延伸完全（见注 6 )。
( 6 ) 使用合适的限制性内切核酸酶（此例是 SphI 和 XhoI ) 酶切以上得到的 PCR 产物和载体 pQE-32△F [ 1，2 ] ( 见注 7)。
( 7 ) 纯化酶切产物同第（4 ) 步。
