一种基于磁性石墨烯的纸基电化学发光夹心免疫分析方法
1 引 言
电化学发光免疫分析（ECLIA）将电化学、光谱学和免疫学紧密结合，具有电化学电位的可控性、发光分析的高灵敏度及免疫反应的特异性，在医疗诊断具有良好的应用前景[1]。磁悬浮免疫分析（MSIA）不仅保持了悬浮分析的所有优点，利用磁性免疫复合物在近似均相的条件下实现快速的免疫反应，还可在外加磁场作用下高效分离免疫复合物与游离蛋白，已应用于临床免疫学检验中[2]。
目前已有商品化的ECLIA仪器，如罗氏系列ECLIA系统，可进行多种临床样品的定量检测，检测下限可达pmol/mL，线性范围最大超过7个数量级。但是这些管道式仪器存在样品用量大、反应池需定期清洗、仪器价格和配套诊断试剂价格昂贵等不足之处。可抛式传感器件由于一次性使用的特点，可以避免以上管道式传感器件存在的问题。2007 年首次提出的纸基微流控芯片[3]是当前制作可抛式传感器件的重要方案之一，研究者基于纸芯片进行了ECL检测[4～9]，但要实现在实际检测中的广泛应用，还需解决纸芯片的加工和修饰、纸芯片流体控制、ECLIA 检测灵敏度以及稳定性问题。目前文献报道的疏水材料尚不能解决阻挡低表面张力的样品渗透或者成本过高的问题； 以毛细作用驱动纸芯片流体运输的方式常造成样品在流动过程中挥发，无法满足复杂样品的多步预处理与反应、多组分同时检测等要求。目前报道的纸基电化学发光检测方法在灵敏度、稳定性方面尚达不到商品化高精密仪器的水平。
磁性纳米材料由于兼具纳米材料的特性和磁响应性，作为分离/固定生化物质的理想载体，广泛应用于分离/富集、免疫分析等领域[10～18]。可通过物理[19]或化学[18，20，21]方法对不同类型的磁性纳米材料进行表面功能化，进而固定抗体或抗原获得磁性免疫复合物，建立磁高效分离[18～20，22]或可以反复再生[18]的免疫分析方法。
本研究选择一种更为简便的方式――纸基电极，即在印刷电极上，紧密覆盖与电极区域大小相等的纸片，由于免疫过程与检测过程的分离，构建的纸基电极无需复杂的几何通道和疏水界面，少量体积的分析物即可通过毛细作用迅速运输至电极表面，结合磁性石墨烯独特的理化性质，以人IgG为模型分析物，最终建立一种简便、灵敏、低成本可抛式纸基电化学发光检测新方法（见图1），为避免管道式分析仪器样品用量大、成本高等问题提供一种新策略。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
纸芯片电化学发光测试仪由本实验室与西安新启特仪器仪表有限公司联合研制，结构见图2：光电倍增管（PMT）接收窗直径10 mm，纸基工作电极位于接收窗中心，两者间距3 mm； 纸基电极的触点和电路的导线采用弹性连接； 电路中取样电阻、分压电阻等关键器件采用温度控制。纸基电极（Paperbased SPE），由直径为6 mm 1#滤纸片（英国Whatman公司）紧压于TE100印刷碳电极（SPE，三电极体系，台湾禅谱公司）电极区域制成。15 mL磁分离架、8孔磁分离架（德国Millipore公司）； PalmSens3便携式恒电位仪（荷兰Plamsensor公司）； Multiskan GO 全波长酶标仪（芬兰Thermo Fisher Scientific公司）； BRUKERAXS 转靶X射线粉末衍射（瑞士BRUKER 公司）； Gemini SEM场发射扫描电子显微镜（德国卡尔蔡司公司）； Zeba脱盐离心柱（美国Thermo Scientific公司）。
2.2 实验方法
2.2.1 磁性石墨烯固定一抗 称取2.5 mg 磁性石墨烯于5 mL水中，超声分散，再加入5 mL 0.02 mol/L MES缓冲液（pH 5.5）混匀，分别加入90 mg EDC、100 mg NHS充分溶解，150 r/min下振荡25 min，磁分离，水洗3次。量取50 μL 1 mg/mL Ab1， 用10 mL 0.02 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.3）稀释，加入活化好的磁性石墨烯中，37℃ 150 r/min 振荡孵育2 h。磁分离，超纯水洗涤3次，分散于10 mL抗体稀释液（含1% BSA的0.01 mol/L PBS，pH 7.4）中，4℃保存，待用。
2.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）测定捕获抗体反应性 取5 mg 磁性石墨烯分散于10 mL 抗体稀释液中， 37℃振荡混匀2 h，备用； 分别取500 μL磁性石墨烯、磁性石墨烯固定的Ab1分散液，加入200 μL 1000倍稀的HRP标记的兔抗羊IgG， 37℃振荡混匀2 h； 磁分离，LIVZON洗液洗涤5次，每次8 min； 加入200 μL 1∶1配制的显色底物A&B，显色10 min； 取100 μL显色后液体于ELISA板中，加入50 μL 2 mol/L H2SO4 终止反应， 450 nm波长下测定吸光值。 2.2.3 酯化钌标记二抗 参考文献[23]方法并略有改进。取100 μL 1 mg/mL Ab2加入2 mL 0.1 mol/L PBS （pH 8.5）中，加入100倍摩尔比的9.8 mmol/L酯化钌（溶于DMF），常温150 r/min振荡孵育2 h。使用Zeba脱盐柱去除游离酯化钌，2280 r/min离心2 min，收集酯化钌标记的Ab2。
2.2.4 免疫检测 磁性石墨烯固定Ab1、不同浓度抗原、酯化钌标记的Ab2各取50 μL，37℃150 r/min振孵育30 min； 磁分离，超纯水洗涤3次，分散于5 μL 80 mmol/L N丁基二乙醇胺（0.1 mol/L PBS，pH 8.5）共反应物中，备用。移取上述混合液滴加至纸基电极上，在0.2～1.5 V范围内以0.1 V/s的速率进行循环伏安扫描，在PMT 1000 V下检测电化学发光响应。
3 结果与讨论
3.1 一抗的固定与表征
磁性石墨烯的X射线衍射（XRD）图谱如图3A所示，在30.1°（220） 、35.4°（311）、 43.02°（400）、53.4°（422）、57°（511）和62.6°（440）处可见尖锐的强峰，对应Fe3O4的fcc立方结构，将（311）位置处Bragg反射峰宽代入Scherrer公式[24]，估算出颗粒粒径尺寸为40 nm。此磁性石墨烯可形成近似均相的悬浮溶液（见图3B），在磁场的作用下可以迅速聚集（图3C）。
处存在蛋白质酰胺Ⅲ带NH面内变形振动，说明Ab1与磁性石墨烯通过酰胺化反应成功偶联。磁性石墨烯的SEM图像（图5Ba）呈现由随机皱缩的多层薄片相互紧密结合形成无序的固体表面，这种表面为负载Ab1提供了高比表面积； 当磁性石墨烯固定Ab1后， 表面（图5Bb）表现出更为粗糙的结构，而这种结构有利于接近免疫复合物。采用ELISA考察固定后Ab1的反应性，结果显示， 固定组的吸光度显著高于未固定组（图5C），间接证明了磁性石墨烯表面有Ab1存在。
3.2 二抗的标记与表征
使用紫外可见吸收光谱考察Ab2的电化学发光标记效果，由图6可见，酯化钌分别在245 nm（金属到配体电荷转移（d →π*））、282 nm（配体内的电荷跃迁（π→ π*））[25]、456 nm（自旋允许的金属到配体电荷转移（d→π*））[13]处有特征吸收峰； Ab2分别在204 nm（肽键）及280 nm（共轭双键）处有特征吸收峰。Ab2通过酰胺键与酯化钌共价结合形成钌标抗体（RuAb2）复合物，在455 nm处出现的吸收峰证明了钌复合物与Ab2结合。
3.3 纸基电极电化学发光传感器的响应特性
采用磁性石墨烯修饰电极，不仅可以通过磁分离将非特异性吸附影响降至最低，而且其高的电子传递性能，使其具有更快的生物反应动力学，30 s内即可获得较高信噪比的响应曲线。此外，本方法试剂和样本用量少（150 μL/次），检测成本低； 纸基电极所需检测体积小，5 μL 磁性免疫复合物重悬液即可满足分析需求。
3.3.1 线性范围和检出限 对人IgG抗原进行梯度稀释，考察构建的纸基电极电化学发光传感器的响应特性（图7）。在最优的检测条件下，传感器的电化学发光强度随IgG浓度的增加而增大，且电化学发光响应峰面积在0.32～1000 ng/mL浓度范围内，与IgG浓度对数值呈良好的线性关系，检出限为6.4 pg/mL（S/N>3），所构建的分析方法可用于人IgG定量检测，具有较高的灵敏度。
3.3.2 选择性和重复性 在优化的条件下检测BSA、人IgA、AFP和人IgG的电化学发光响应情况，考察所构建方法的特异性。如图8所示，3种干扰物质的电化学发光强度远低于IgG的电化学发光强度，说明BSA、人IgA、AFP基本不干扰对人IgG的检测，
4 结 论
本研究在ECLIA及MSIA的基础上，利用电化学发光灵敏度高、动态范围宽、抗干扰能力强的特性，利用免疫磁性颗粒使免疫反应在近均相的条件下实现快速的反应动力学，通过外加磁场快速高效地分离游离蛋白和免疫复合物； 利用磁性石墨烯的高效负载能力和信号传递性能，进一步提高分析灵敏度，缩短检测时间； 利用可抛式纸基电极，简化了操作步骤，减少了试剂（样品）用量，降低检测成本，最终构建的基于磁性石墨烯的纸基电化学发光夹心免疫分析方法具有较宽的线性范围，较高的灵敏度、稳定性和特异性，可实现IgG的定量检测，在低成本、快速免疫检测领域有一定的应用前景。
