在小规模的SFC纯化中使用ELSD触发馏份收集的可行性
引言
当比较HPLC和SFC的多项应用时，有人发现SFC因超临界液体的低粘滞度和高扩散率而能提供更好的选择性和更短的分析时间。
SFC用于制备模式时可显著降低成本，这是因为馏份通常收集在较小体积的挥发性醇中而由此减少了相当多的纯化后续工作。乙腈（ACN）的持续短缺也促使多个行业对SFC在分析和纯化方面能否替代乙腈依赖性反相液相色谱（RPLC）进行评价。现在，科学家在探寻、企业也在开发更多适用于SFC的包括UV、FID、MS和ELSD在内的检测器。
蒸发光散射检测器（ELSD）最初为高效液相色谱（HPLC）进行基于质量的非挥发性化合物检测而设计1。因为这种检测机制不依赖于化合物的光学属性，所以ELSD被认为是一种通用检测器，特别适用于检测不存在紫外光发色团的分析物。很多制药实验室和化学实验室将ELSD与紫外检测和质谱（MS）同时使用，以确保用于对组成各异或比较复杂的混合化合物进行色谱分析的通用检测的“真实性”。ELSD也被发现可广泛用于包括膳食补充剂、运动营养品、维生素、有机食品、饮料、化妆品和美容产品在内的天然产品的分析和纯化。
我们曾报告过使用SFC ELSD分析运动饮料中甜味剂的个案研究2以及对SFC ELSD试验参数所进行的详细评价3，这两项研究均采用分析规模。我们在此呈现关于ELSD用于小规模制备型SFC的可行性研究。我们希望此处所述的结果能促进专业人员将ELSD并入涉及分析和制备规模SFC的日常工作流程中。
试验
材料
酮洛芬和对乙酰氨基酚购自西格玛奥德里奇公司（美国密苏里州圣路易斯市）。将酮洛芬和对乙酰氨基酚溶解于HPLC级甲醇中，制得用于分析试验的0.5 mg/mL储备液和用于纯化的5 mg/mL储备液。硅胶柱（分析型：4.6 x 250 mm，填充5 μm颗粒；制备型：10 x 250 mm，填充6 μm颗粒）购自普林斯顿色谱仪器公司（美国新泽西州普林斯顿）。
色谱分析
各项试验均使用配备沃特世2998型光电二极管阵列（PDA）检测器和沃特世ELSD（美国马萨诸塞州米尔福德）的一台SFC Investigator II仪器（沃特世子公司T harSFC，美国宾夕法尼亚州匹兹堡）进行。
ELSD信号（模拟信号输出）通过模数转换器传输到SuperChrom软件。一个10 μL的定量环用于各次分析型进样，而一个200 μL的定量环则用于各次制备型进样。ELSD使用一根内径0.010英寸的不锈钢三通和25 μ x50 cm的PeekSil管在PDA和反压调节器之间分流出来。分析型方法在流速为4 mL/分钟（85:15 CO2/甲醇）、反压为150巴和温度为40?C的条件下运行。分析型方法的ELSD条件设置如下：增益=1000、喷雾器温度= 45?C、管道温度= 45?C、压力= 30 psi。制备型方法在流速为10 mL/分钟（80:20 CO2/甲醇）、反压为150巴和温度为40?C的条件下运行。ELSD条件设置如下：增益=1000、喷雾器温度= 28 ?C、管道温度= 50 ?C、压力= 60 psi。收集装置上的补偿泵被设置为每分钟用泵抽吸2 mL甲醇。对于纯化应用，以200μL的进样量连续进样五次，或者说每种化合物进样1 mg（两种化合物共2 mg），那么每种化合物的进样总量为5mg（两种化合物共10 mg）。
结果和讨论
图1显示了使用ELSD和UV得出的酮洛芬/对乙酰氨基酚混合物的分析型SFC色谱图。ELSD和UV信号之间略微存
在时间滞后（约2秒）。由于ELSD信号用于馏份触发，因此滞后时间对制备型色谱特别重要。应充分注意确保信
号处理时间与流出液达到收集阀的时间保持一致，或者需要进行适当的计时补偿，以尽可能减少收集过程中的
损失。例如，在我们的试验中使用了一根25 μ × 50 cm的PeekSil管，以将主流量分流到ELSD中。首选小内径管，
以尽可能减少进入ELSD的流量，实现样本损失量的最小化。然而，管长由UV和ELSD信号之间的时间滞后而决
定。较长的管子将因抗性增强而进一步减少流入ELSD的样本量；然而，这也将增加两种信号之间的时间滞后。
在本例中，2秒的时间滞后小于总峰宽的3%。
其次，我们优化了制备型进样的ELSD设置，结果如图2所示。从分析型到制备型设置出现了两个改变：流速从4 mL/分钟提高到10
mL/分钟，改性剂百分比从15%增加20%；这两种改变将导致流入ELSD的液体增多。在我们的前一项研究3中，对气体流速和蒸发温度的作用进行了描述。简言之，气体流速越高，停留时间就越短，出现散射的次数也越少，进而信号越差。气体流速越高，喷雾过程中所形成的小颗粒就越多。粒径的减小也导致散射光的强度降低。此外，也建议将蒸发温度维持在尽可能低的水平下，以保持粒径的一致性，并通过增强溶解结晶作用而获得更好的信号。这一点与图2所示的结果吻合：增加气体流速和降低蒸发温度似乎可产生带有更少“尖峰”的更窄色谱峰。注意制备型进样的样本浓度要高得多；灵敏度不再是主要关注点。恰恰相反，优化目标在于产生可靠且重现性好的信号。有代表性的制备型SFC色谱图见图3。图3(b)显示了叠加进样的SFC色谱图。循环时间通过进行叠加进样而更为缩短，进一步提高了产能。回收率和纯度通过再次进样所收集的馏份并将由此得到的峰面积与预先绘制的校准曲线进行比较而确定。在本研究中，酮洛芬和对乙酰氨基酚的回收率分别为88%和84%，纯度分别为98%和100%。
结论
在本研究中，我们证实了使用ELSD可触发小规模制备型SFC的馏份收集。本研究所用标准品的回收率大于84%，纯度大于98%。仪器配置和ELSD优化方面的根本原则应该同样适用于大规模制备型SFC。
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