lncRNA促进胃癌进展的新机制研究思路分析（二）

2. GC细胞中FOXD2-AS1富集高的患者预后较差

在芯片数据GSE51575基础上，以正常组织作为对照，来评估FOXD2-AS1的诊断效果。ROC曲线下面积为0.919（95%置信区间[CI] 0.809-0.976; P < 0.0001）;特异性和敏感性分别为0.885和0.885。此外，发现区分肿瘤组织的临界值为10.925（△Ct）和AUC为0.709（95% CI 0.643 -0.769; P < 0.0001），特异性和敏感性分别为0.726和0.632。利用Kaplan-Meier (K-M)曲线和log-rank方法分析FOXD2-AS1富集与无病生存(DFS)之间的相关性，发现高富集FOXD2-AS1的患者比低富集FOXD2-AS1的患者预后差。

图3. FOXD2-AS1与GC患者预后关系

3. FOXD2-AS1是体外和体内的肿瘤诱导因子

为了评估FOXD2-AS1是否能促进GC进展，基于芯片数据GSE51575进行GSEA分析，结果显示，细胞周期和DNA复制两个增殖指标与高FOXD2-AS1表达组和低FOXD2-AS1表达组的基因特征最为相关。GO分析揭示了在FOXD2- AS1敲除的细胞中与细胞周期和DNA复制相关的基因的变化。此外，采用qPCR和WB检测发现FOXD2-AS1富集变化显著改变了肿瘤发生的关键基因的特征，提示FOXD2-AS1可能是胃肿瘤发生的关键调控因子。采用基因沉默和过表达的方法，揭示在裸鼠中FOXD2-AS1功能缺失能够抑制胃癌细胞的细胞周期进程，而FOXD2-AS1的表达上调能够促进癌症进展。

图4. FOXD2-AS1对GC进展的影响

4. FOXD2-AS1通过与EZH2、LSD1相互作用改变EphB3表达

既往研究表明，lncRNA通过RNA结合蛋白调控下游因子，是否FOXD2-AS1介导的调控同样通过类似的机制发生，研究者利用生物信息学方法结合RIP测序、RNA pull down技术最终验证了FOXD2-AS1通过与甲基转移酶EZH2和去甲基化酶LSD1的结合在GC细胞中发挥重要的调控作用。从RNA测序数据来看，FOXD2-AS1减少时，EphB3表达增加。敲除FOXD2-AS2后，发现EphB3表达显著增加，而异位FOXD2-AS1表达降低了EphB3 mRNA的富集。WB证实了FOXD2-AS1的敲除和过表达在GC细胞中分表上调和下调了EphB3的水平。为了确定FOXD2- AS1是否通过将EZH2和LSD1招募到GC中的EphB3启动子区来抑制转录，这里进行了功能的敲除和回补实验以及ChIP检测，发现EZH2和LSD1沉默后，EphB3上调。FOXD2-AS1的敲除降低了GC细胞的结合能力和诱导的修饰，而对照细胞则通过重组shRNA进行转染。为了观察FOXD2-AS1是否直接作用于靶色素，我们利用ChIRP方法分离染色质，分析了FOXD2-AS1依赖的EZH2/LSD1靶基因EphB3的位点，并使用qPCR检测。ChIRP结果显示FOXD2-AS1被招募到GC细胞的EphB3启动子中。最后，在GC组织中评估EphB3表达，与FOXD2-AS1呈反比关系，同时，FOXD2-AS1过表达导致的EphB3沉默被同时EZH2或LSD1敲除逆转。这些结果表明FOXD2-AS1可以将EZH2和LSD1引入到EphB3启动子中，抑制其转录。

图5. FOXD2-AS1通过与EZH2、LSD1相互作用改变EphB3表达

5.促EphB3表达可抑制GC细胞增殖

数据显示，相对于正常组织，GC组织中对EphB3的富集显著降低，低的EphB3表达表明疾病进展。此外，将FOXD2-AS1与EphB3表达结合，可获得较好的预后价值。使用IHC对106个匹配的GC及周围正常组织的EphB3蛋白水平进行了评估，发现在约80%的非瘤性胃组织中，EphB3信号呈阳性，且这些肿瘤组织与周围正常组织相比，大多表现出较低的EphB3蛋白表达。此外，EphB3蛋白表达水平越低，疾病阶段越晚期。上述结果表明，低EphB3表达与GC进展有关。EphB3转染实验显示EphB3与FOXD2-AS1诱导的GC细胞增殖有关。拯救实验验证了FOXD2-AS1通过阻断EphB3表达来调控GC细胞生长。

图6.促EphB3表达可抑制GC细胞增殖

总结：

南京医科大共同发表的这篇研究成果，为胃癌发生的机制提供了全新的认识。文章揭示FOXD2-AS1可能是胃癌关键的肿瘤促进基因，并有可能成为胃癌潜在的生物标志物和治疗靶点。回顾全文，从实验设计、开展，再到数据的分析，每一个思路每一个方法都值得我们学习和借鉴，正确的选择是成功的一半，这些都离不开云序生物强大的科研团队所做出的贡献。

全文信息：

Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y