实验方法原理 DNA 可以同时从琼脂糖两面向两张膜上转移。当需要用两种不同的探针分析相同的限制性内切核酸酶酶切片段时，这种方法是很有用的。DNA 片段转移速率较快，但是由于凝胶中的液体从两侧同时流出导致脱水速率太快，所以转移效率较低。当靶序列的浓度较高时这种方法效率最高，例如分析克隆的 DNA 时（质粒、噬菌体、黏粒、PAC 或 BAC ) 或者不太复杂的基因组时。用这种方法转移的哺乳动物的基因组 DNA 太少以至不能重复或及时地检测到单拷贝序列杂交信号。

实验材料 限制性内切核酸酶DNA 分子标记物靶 DNA

试剂、试剂盒 变性溶液HCl中和缓冲液中性转移缓冲液SSC蔗糖凝胶上样缓冲液SYBR Gold 或溴化乙锭

仪器、耗材 无溴化乙锭的琼脂糖凝胶交联设备玻璃烤盘尼龙或硝酸纤维素膜旋转振荡平台厚的吸水纸荧光标记的透明尺

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液及溶液

变性溶液（1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH）

HCl ( 0.2 mol/L) 应用于 DNA 脱嘌呤

中和缓冲液（1 mol/L Tris ( pH 7.4)，1.5 mol/L NaCl）

中性转移缓冲液（10X SSC)

6X SSC

6X 蔗糖凝胶上样缓冲液

SYBR Gold 或溴化乙锭

2. 酶及缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

3. 凝胶

用无溴化乙锭的 0.5X TBE 或 1X TAE 配制的 0.7% 的琼脂糖凝胶

4. 核酸及寡聚核苷酸

DNA 分子标记物

靶 DNA

5. 专用设备

交联设备（例如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-Rad), 或者微波炉，或真空炉

玻璃烤盘

玻璃板

尼龙或硝酸纤维素膜

旋转振荡平台

厚的吸水纸（例如，Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

荧光标记的透明尺

重物（400 g )

二、方法

1. 消化 DNA 并根据方案“Southern印迹（毛细管法将 DNA 转移到膜上）”步骤 1~3 所述凝胶电泳分离 DNA 片段。

2. 凝胶电泳分离 DNA 以后，用溴化乙锭或 SYBR Gold 染色并照相。将一透明荧光尺放在凝胶边缘以便从照片上根据迁移距离直接读出 DNA 条带的大小。在中性条件下准备转移用的凝胶。

3. 用干净的解剖刀或切纸机切下两张每边都比凝胶大 1~2 mm 的尼龙或硝酸纤维素膜。切下膜的一角，使之与凝胶的切角对应。切 4 张与膜同样大小的厚吸水纸。

4. 将膜漂浮于盛有去离子水的皿中直到膜从下往上完全浸湿，然后将膜浸入 10 X SSC 中至少 5 min。

5. 每层都用吸管赶走气泡，尤其是膜与凝胶之间。将一张膜放在两张潮湿的吸水纸上。将凝胶放在膜上，二者切去的一角对齐。立即将另一张膜放在胶的另一面，然后是两张潮湿的吸水纸。

6. 将夹在一起的吸水纸、膜以及凝胶放到 5~10 cm 高的一叠纸巾上。上面再放置一叠纸巾。将一块玻璃板放在纸巾上并用 400 g 重物压实。

7. 2~4 h 之后，移去吸水纸及纸巾。将凝胶和膜转移到干燥的吸水纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔标记凝胶加样孔的近似位置。

8. 将 DNA 固定于膜上。

9. 直接用探针与固定的 DNA 杂交。

任何不立即用于杂交的膜都应当充分干燥，松弛地包于铝箔纸或吸水纸中，室温下最好保存在真空条件。