植物细胞骨架(cytoskeleton)的观察

一、实验目的

1. 掌握考马斯亮蓝R250 对植物细胞骨架染色的方法。

2. 通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。

二、实验原理

细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

三、实验用品

(一)材料 洋葱

（二）器材 显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH 计

（三）试剂

1. 0.01mol/L 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)

0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml

0.15mol/L NaCl

双蒸馏水加至1000ml

2. PB

0.2mol/L Na2HPO4 77ml

0.2mol/L NaH2PO4 23ml

3. M-缓冲液

咪唑(PH 6.7) 50mmol/L

KCl 50mmol/L

MgC12 0.5mmol/L

EGTA 1mmol/L

EDTA 0.1mmol/L

巯基乙醇 1mmol/L

甘油 4mmol/L

用1mol/L HCl 调pH 至7.2。

4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液

5. 0.2%考马斯亮蓝R250 染液

甲醇 46.5ml

冰醋酸 7ml

蒸馏水 46.5ml

6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）

四、实验操作见图4-4

取洋葱内皮1cm 左右

置于含PBS 液的载玻片上

湿润后，吸去PBS

加2 滴1%Triton X-100/M-缓冲液，5min

吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min

加PBS 洗2 次，共3min

加0.2%考马斯亮蓝R250 染色30min

用PBS 洗2 次，共2min，吸干

镜检并绘图

图4-4 细胞骨架标本制作过程