细胞爬片的免疫组化染色鉴定

实验概要

本实验介绍了细胞爬片的免疫组化染色鉴定操作流程及注意事项。

主要试剂

PBS，0.5%Triton X-100(DPBS配)，3%H₂O₂，封闭血清 (5%正常二抗血清DPBS液)，一抗(PBS配，滴度1：200，湿盒)，二抗工作液(湿盒)，C液(湿盒)，DAB显色液，苏木素，树胶

主要设备

20mm盖玻片，90mm培养皿，电子显微镜

实验步骤

1. 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2×10⁴/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。
2. PBS清洗标本 3次各 1 min。
3. 冰丙酮固定 15 min。
4. 空气干燥 5min。
5. PBS清洗标本 3次各 2 min。
6. 0.5%Triton X-100(DPBS配) 孵育 1次 20 min。
7. PBS清洗标本 3次各 2 min。
8. 3%H₂O₂孵育 15 min。
9. DPBS清洗标本 3次各 2 min。
10. 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。
11. 一抗孵育(PBS配，滴度1：200，湿盒)4℃过夜或37℃ 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液
12. PBS清洗标本 3次各 5 min。
13. 二抗工作液孵育(湿盒) 37℃，30 min。
14. PBS清洗标本 3次各 5 min。
15. C液(湿盒) 37℃，30 min。
16. PBS清洗标本 3次各 5 min。
17. DAB显色(避光，镜下观察至棕色)约3~10min。
18. 蒸馏水洗 2次 1 min。
19. 苏木素复染 0.5~1min。
20. 自来水洗 30min。
21. 树胶封片。

注意事项

1. 良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意：
   1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；
   2) 接种的细胞密度适中，以2×10⁴/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；
2. 冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3. 冲洗时只须轻轻振荡培养皿，(不可用吸管太用力吹，易脱片)。
4. 加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜。
5. Triton X-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。