CRISPR-Cas9基因编辑的两种不同编辑实验流程的应用（二）

【方法二】
1、（用IDT工具）设计sgRNA，使其Spacer与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成sgRNA；
2、将sgRNA与Cas9蛋白混匀，形成RNP；
3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
4、通过sgRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；
5、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复，实现基因敲除；
②（用IDT工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复，实现基因敲入、敲除、沉默等。
 

 
 
 
Alt-R® crRNA序列设计示意图

 
Alt-R® CRISPR-Cas9相关：
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特异性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解，必须与tracrRNA一起使用以形成gRNA。
 
2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，经其他化学修饰，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验，可提高编辑的稳定性。必须与tracrRNA一起使用。
 
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合组成的单个RNA，含有19-20nt的特异性序列（定制）和80nt通用序列，经化学修饰，稳定性更高，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验。相比体外转录的sgRNA，减少细胞免疫反应，更小细胞毒性。
 
4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，远远短于野生型的89nt，缩短后性能提高，经化学修饰，具有核酸酶抗性。可提供荧光标记，检测转染效率。必须与crRNA一起使用以形成gRNA。

图.稳定表达Cas9蛋白的HEK-293细胞，转染Alt-R® crRNA(未标记):tracrRNA(标记)，转染后48小时，荧光显微镜下10倍放大。
 
5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His标签。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
 
6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like内切酶结构域功能失活，对DNA靶向链进行单链切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH结构域失活，对非靶向链单链切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
 
7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，丧失内切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。dCas9蛋白可用于CRISPRi，进行基因下调（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在转录起始位点附近才能发挥功能，其脱靶率远低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
 
8、Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer：是Cas9特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备对RNP的转染效率，进而提高基因编辑效率。
 
9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
 
10、Alt-R® HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率，可同时用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。