Orbitrap的过去、现在和未来
——访Orbitrap发明人Alexander Makarov
【导语】Orbitrap无疑是近20年来质谱技术上最重要的发明，不仅使赛默飞在这个质量分析器上花样翻新、喜获丰收，也给无数的质谱用户带来超乎寻常的极致体验。在重庆举办的第八届中国蛋白质组学大会上，我们有幸采访到Orbitrap的发明人、赛默飞色谱质谱部生命科学质谱研发总监Alexander Makarov，以及赛默飞色谱质谱部负责全球销售的副总裁Herb Kenny，色谱质谱部生命科学质谱的总经理John F. Sos，他们为我们分享了Orbitrap诞生的很多故事，并展望了Orbitrap的未来，希望对所有的质谱爱好者有帮助，激励更多的科学家们为我们带来更多的发明……
Orbitrap的发明人Alexander Makarov
Orbitrap是如何诞生的
迈入质谱门
亚力山大 马可洛夫（Alexander Makarov）1966年出生在俄罗斯Irkutsk的Siberian镇。回顾自己的经历，Makarov说：“我小时候就喜欢发明，并不是喜欢发现大自然界的奥秘，而是喜欢发明世界上还没有的东西。小时候我就发明了一些东西，比如不同的机械，不过可没什么ZL，现在，这些机械已经被真正的发明并应用。虽然小时候的发明并不是很‘成功’，但这是我开始发明的起步。”
大学期间Makarov就显示了惊人的发明才能。他1983-1989年在莫斯科工程物理学院（MEPhI）读大学，88-89年在分子物理系做研究助手，就发明设计了超对数场（hyper-logarithmic field）的多电极飞行时间质量分析器用于火花离子源（spark ion source），并提供了原理的证明，那时候Makarov只有23岁，同时他直接获得了科学硕士的学位奖励。随后89-92年Makarov从师于MEPhI 的A.A.Sysoev教授，完成了物理和数学的博士学位，论文题目是：静态电磁场带电粒子的 准同步运动（Quasi-isochronous motion of charged particles in static electromagnetic fields）。
谈到如何迈入质谱的大门，Makarov说：“我开始从事质谱工作是一个偶然。MEphI主要研究的是核工业，当时也只有这家大学提供质谱的课程。那时的我对真正的科学抱有很罗曼蒂克的想法，渴望快速做出一些引人注目的工作。大学第二年在分子物理系学习时，我开始思考，周围的人们在做什么样的项目，但是没有人特别注意我。除了Sysoev教授，他开始让我学习质谱，我在那里完成了质谱的学习，这种偶然，仅仅是因为别的教授太忙，没有注意我急切的渴求。”
做一个理想的质量分析器：从FTICR到TOF，和23岁的发明
Makarov接下来谈到了发明Orbitrap一直以来的动力，“完成大学课程做研究助手时，我常常撞见一个面目狰狞的研究生，他有天告诉我：‘如果你真的想干点儿有用的事儿，就为我的火花离子源开发一个理想的质量分析器！’这就是我为什么一直努力在做质量分析器，直到现在还在做的真正原因。那时的我并不太了解什么是质量分析器、什么是火花离子源，所以我就开始学习更多知识，学习质谱分析器和离子源。”
鼓励Makarov发明质量分析器的研究生A.Pekaln，以及综述“理想的质量分析器：事实还是虚构”中提到的当时的6种质量分析器：四极杆、三重四极杆、离子阱、磁质谱、TOF、FT-ICR
当时他被一篇1987年的综述深深鼓舞。综述的题目是：The ideal mass analyzer: fact or fiction（理想的质量分析器：事实还是虚构），作者单位是不莱梅的Finnigan MAT公司。综述中强调，“理想的质量分析器”的挑战是真实存在的。结果多年后Makarov来到了作者单位的这家公司并工作至今。（注：赛默飞公司质谱部门的一个重要工厂在德国布莱梅，以前叫做Finnigan MAT）。
综述中列出了那时的6种质量分析器，磁质谱、四极杆、三重四极杆、离子阱、FTICR，TOF，并形象地把它们画作6个孤岛，岛与岛之间是分离的，因为每种质量分析器有如此不同的分析参数。那么，哪一个岛是可能帮助他发明那个“理想的质量分析器”呢？
首先，Makarov先被FT-ICR吸引，它的性能超出所有其它的分析器，分辨率、质量准确度、灵敏度，各项性能都接近“理想”。不过有个重大的缺陷导致其“很不理想”，需使用巨大的磁场。“当时我可没过多学习磁场的知识，不太理解也不喜欢巨大磁场这种方式，这可不是我的菜。”Makarov说。
有次他发问：“捕获这些离子，我们能不用磁场、只用静电场么？”得到一干众人的回答是：“?*?!%，你不知道离子不能在静电场中休息（rest）么？”
这条反问绝对正确！物理学中有条恩绍定理(Earnshaw's theorem)：
点电荷的集合不能被稳定维持在仅由电荷的静电相互作用构成的一个稳定静止的力学平衡结构中。
这是真的，不久后他意识到这句话的关键词，如果移去 “静止的”这个关键词，而是让离子动起来，那么离子就可能稳定。
因此，Makarov把目光从FT ICR投向其它的质量分析器。不久后，他发现了上述反问和定理的关键限制因素是：“休息（rest）”和“静止不动（stationary）”。离子必须动起来，而不是停在那儿，然后他们就可能在静电场中变得稳定！这就像我们的太阳系保持稳定，或是人造地球卫星环绕地球稳定运动一样。事实上，这个想法很早就在一个叫Kingdon的阱中实现了，被用于光谱，但很难变成质谱的装置。因为它拒绝所有从外部进入Kingdon阱中的离子，内部也无法放置任何检测器；即使前两项没问题，质量分离的能力也非常弱。“因此后来我有很多年都没再研究Kingdon阱。”
说明：Orbitrap脱胎于由通用电气公司的K. Kingdon于1923年发明的一个称为Kingdon trap的离子捕集装置。Orbital device这个装置不使用任何磁场或高频电场，仅使用静电场捕集离子。用于捕集离子的静电场是由一个作为外电极的金属圆筒和一条作为中心电极的细铜线构成。在两个电极之间施以直流电压，即可建立一个以中心电极为轴心的非线性对数电场。离子可沿轴线运动、可以稳定，不会撞壁，但却无法沿轴向引出。
接下来，Makarov专注于开发一种具有理想时间聚焦能力的TOF，在博士论文中，他发展了理想的TOF聚焦理论，并成功地搭建了使用这种“quadro-logarithmic”四极对数场的装置；发明了带轴向反射的旋转TOF镜，并参与设计了装配大面积尘埃效应离子源的TOFMS，用于分析行星际的微小陨石。“我摸索着、跌跌撞撞地研究出一种合适的电场，后来再次成为orbitrap的基础。这种电场被环形电极约束。我喜欢这种电场，因为它在特定方向上提供了很好的TOF聚焦，这个技术被用在了开始那个研究生让我设计的火花离子源TOF上。这种TOF能够得到相对高的分辨率，Gall L.N., Golikov Y.K., Aleksandrov M.L., Pechalina Y.E., Holin N.A. SU Pat. 1247973, 1989. 当时，我的母亲说我发明了一个‘捕蚊器（mosquito-catcher）’。后来我还做了许多类似的‘捕蚊器’，还在被人们使用。”
Orbitrap：做一个全新质量分析器，综合FTICR、TOF和离子阱的优点
随着前苏联解体，国家陷入混乱，期间Makarov却正痴迷于研发各种TOF，并发明了多种理论和仪器（详见本文附录），如：Dust impact TOF、REMPI-TOF、MALDI-磁扇/TOF、MALDI –TOF/TOF等。1996年，Makarov加入曼彻斯特的小质谱公司HD Technologies，加入时是该公司的第4个员工，直到2000年该公司被ThermoFinnigan（现在的赛默飞）收购。公司的创建者是Steve Davis，他告诉Makarov说：
“对我们这个小公司，如果要成功，我们需要在车库中创建全新的技术。它最好同时具有FT ICR的分辨率、有线性TOF的灵敏度、有四极离子阱的小体积和各种性能。”
这真是一个挑战。
由于电磁扇形和四极杆质量分析器都是连续接受离子，其它几种都是脉冲接受离子的，所以不再考虑这两种；而需要综合FTICR、离子阱、TOF的优点，采用一些技术来消除它们的缺点。
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FTCIR | 离子阱 | TOF |
| 分辨能力 | 优秀 | 中等 | 中上等 |
| 离子传输效率 | 中等 | 优秀 | 差 |
| 质量准确度 | 优秀 | 差 | 优秀 |
| 动态范围 | 优秀 | 优秀 | 优秀 |
| 速度 | 中等 | 优秀 | 优秀 |
| 定量 | 优秀 | 中等 | 中等 |
| 所有离子的检测 | 优秀 | 优秀 | 优秀 |
| 使用简单性 | 差 | 优秀 | 中等 |
| 拟消除缺点的方式 | 镜像电流检测 | 提高离子捕获能力，使用修改形状的电极 | 脉冲进样，静电场 |
这时Makarov又想起了Kingdon阱，当时的困难是：它拒绝所有从外部进入Kingdon阱中的离子，内部也无法放置任何检测器；即使前两项没问题，质量分离的能力也非常弱。然而，当同样的原理被用于经过改良的电极结构后，它几乎变成了一个理想的Kingdon阱。被称为理想是因为轴向的振荡行为很像谐波振荡器：轴向频率ωz不依赖于离子的动能和位置。因此，可仅将轴向频率用于质量分析。“理想的King阱”具有Quadro-logarithmic电场，成为了Orbitrap质量分析器。其中，改良的电极结构为：将内外电极都改为纺锤形，在外电极上开口。
Orbitrap电场势能场特性
离子轴向转动频率ωz不依赖于离子的动能和位置，直接与质荷比有关
用镜像电流可检测离子。在Orbitrap中，不同m/z有不同的轴向谐振频率，在裂口的外电极上可感应出镜像电流；多个离子产生一个叠加的复杂频域信号，用傅里叶变换技术可以测定频率，计算出其m/z，这非常像FTICR。
那么如何捕获离子？离子在Orbitrap中有三个方向的运动，只有轴向转动仅与m/z有关，那么激发离子开始运动后，就可以在外电极感应检测。这样排除了阱内部的影响，所有离子都被检测，将噪音水平降到极低，可获得高灵敏度。
解决了离子捕获和检测的问题后，如何使离子从外部进入Orbitrap？
首先，可以把同一m/z的离子做成一个窄包（short packet）；然后提高电压压缩离子；进行“注入激发（Excitation by injection）”初始化；使电压和离子轨道稳定；离子就会呈角扩散形式的旋转环沿轴来回谐振。
公司缺乏资金，Makarov用英国政府提供的有限的SMART基金，购买了一些实验器件就开始工作了。这套使用激光源的装置大部分由Makarov本人搭建，同事Robert Lawther做工程化部分，Andy Hoffmann做电子学部分，Steve Davis博士做科学部分。Makarov终于做出了证实原理的带激光离子源的Orbitrap质量分析器，1998年10月采集到了第一张谱图，1999年年中提高装置的分辨率至150,000，该结果首次在1999年ASMS（Dallas, TX）上被报道。
2000年，ThermoFinnigan收购了HD Tech.公司，并入其在英国的MassLab子公司，但收购的主要原因不是为了Orbitrap，而是HD Tech.公司拥有的TOF技术。随后到2002年，该公司决定关掉英国的MassLab公司全部搬至德国的不莱梅，很多原TOF技术团队的员工都不愿到德国，结果TOF项目最终停止了，比如赛默飞后来停产了Tempus GC-TOF。
“Orbitrap项目后来得以生存并发扬光大，这里侥幸地是因为Orbitrap团队的3个核心成员都到了不莱梅；而原TOF团队的核心成员都不愿意去不莱梅。”Makarov谈到此处非常感慨：“所以我们有一个重要的经验教训，在高科技研发领域，人是最重要的，而不是技术本身。当你只是做生产，这是相对简单的；而如果你是开始一项新技术，所需的知识和动力都来源于人，新技术没有人是无法自己开始的。”
Orbitrap的商品化道路
对原理的证实是非常棒的，但仍无法保证orbitrap能够被成功地开发为商品化仪器。
Makarov回顾说：“1999年后，Orbitrap至少还有12个遗留的难点问题。第一个就是，现有的Orbitrap用脉冲源，无法提供一个满足要求的时空参数的离子包，用于连续离子源。仅这一点就很致命，因为Thermo那时的离子源全是连续流的，而我们的公司刚被Thermo买了。克服这12个难点还有很长的路要走。”
“发明orbitrap分析器只是第一步，后来还有7-8次路线变化（turns）。每一次路线变化时，我们都必须舍弃原来的想法，开始一个新的，因为那些想法后来运行得不好。我们必须根据环境和情况不断调整，从而使orbitrap可以克服各种困难继续下去。
我不知道项目是否可以永久进行下去，从没有人承诺过我。不过每一次我们都不仅仅采用一条路线，而是在此研究中并行探索几条路线，从而以防万一，这样一条路实在走不通时，我们可以跳到第二条路上。这意味着你从来不应该把自己局限在一个想法上，而应该想20种可能，正是这20种可能后来挽救了orbitrap。因为每一次开始最显而易见的道路、最清晰的道路，往往被证明是错误的，我们需要跳转到另一条路上。比如C-trap、分析器、orbitrap的生产等等。这种‘在盒子之外思考、及时跳出’的能力，对于orbitrap的成功至关重要。”
在英国MassLab时，项目组集中精力开发Orbitrap同连续源（而不是脉冲源）的接口。Mark Hardman参与了全部的工作。2001年，项目组得到了使用外部RF-only存储器（后被称作C-Trap）、积累大量离子、然后快速注入orbitrap分析器的第一组数据。C-trap解决了离子引入orbitrap的关键问题，C-trap可以存储积累离子，并且可以将orbitrap跟外界彻底去耦合，因此将可以和任何的离子化手段或碎裂方式相连。进一步的研究中，项目组加入了更多至关重要的人，如电子工程师Alexander Kholomeev，Eduard Denisov博士，项目组开始集中精力研究离子光学、并进行orbitrap技术平台的机械和物理设计。
项目组后来面临真空、供电、检测系统等更多的严峻挑战。赛默飞于2002年7月决定关闭曼彻斯特工厂，将Orbitrap的研发项目组搬迁到德国布莱梅，让全公司的质谱研发资源可以更好地支持Orbitrap项目。而Masslab项目组集全力搭建的那台仪器于2003年1月被搬到了美国普渡大学Graham Cooks教授实验室，该系统继续运转至今。
在德国不莱梅，Orbitrap项目组有了一个更好的家。轴向存储的限制、产率挑战、电子和真空技术的缺点，团队不断面临一个个威胁和挑战，最终他们都发明了新型解决方案，攻克了难题。项目攻关期，更多不可或缺的天才加入团队，包括：项目经理Stevan Homing博士，机械工程师Wilko Balschun，仪器软件工程师Oliver Lange，电子工程师Frank Czemper和 Oliver Hengelbrock，科学家Gerhard Jung博士和Kerstin Strupat博士，测试工程师Wilfried Huels等等。
2005年，赛默飞在San Antonio的ASMS大会上推出了商品化的LTQ Orbitrap，它将LTQ和Orbitrap组合使用，充分利用LTQ线性离子阱实现离子分离、裂解和多级质谱MSn功能，LTQ分离后的离子经过反射曲线多极的C-trap，再到达Orbitrap，可进行高分辨率、高质量准确度的分析；Orbitrap是20余年来出现的一种全新的质量分析器。随后LTQ Orbitrap获得2006年Pittcon金奖，2006年R&D 100创新奖。Makarov本人于2007年获得默克奖（Heinrich-Emanuel Merck Award）、2007年俄罗斯质谱学会金奖、2008年美国质谱学会的杰出贡献奖。迄今，Orbitrap已经在全球售出几千台。
从2005-2013年的8年来，Orbitrap几乎年年有新产品、新技术推出。下图时间轴左侧是新技术，右侧是商品化的里程碑。几项突破性的技术分别为：仅使用Orbitrap单分析器的Exactive，串联四极杆的Q-Exactive，ETD/ECD/HCD多种裂解技术，双压阱、S-lens，高场Orbitrap，增强的傅里叶变换性能，三合一的Orbitrap Fusion。
当小编问Makarov，他的梦想是否实现时，他回答说：“还没有。多年前当我完成博士学业时，我发现质谱研究和生命系统有关，这是我第一次意识到自己有机会从事一种研究，有可能挽救人们的生命，这是鼓舞我继续从事质谱事业的原因。现在Orbitrap虽然已经获得成功，但我的梦想是Orbitrap能用于每一家医院做临床诊断，能够帮助改善人们的健康。如果这个梦想实现，我会非常高兴。不过，还有很长的一段路要走。质谱技术才刚刚进入临床分析，对Orbitrap来说，进入临床要比简单的质谱来得更晚些。因此，在我们面前还有很多年的工作要继续。”
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