高速逆流色谱技术在中药成分分析中的应用

　　玄参属于玄参科，药用玄参主要采取玄参的干燥根进行炮制。玄参在我国是非常常用的道地药材，具有清热解毒、凉血泄火、滋阴补肾的作用。在临床上多用于治疗盗汗、便秘、喉咙肿痛、吐血、咳血、热病、烦躁、口渴、疥疮等[1]。高效逆流色谱技术是一种新型的液相色谱技术，由于该技术能够快速对化合物进行分离与分析，理论塔板数可达几千以上，因此较高效液相色谱而言，具有更为显著的优点。由于高效逆流色谱技术不采用固相载体作固定相，因此能够降低样品吸附、样品污染、样品损失等情况的发生，并使峰形更佳，避免发生拖尾现象[2]。目前对于高效逆流色谱技术在中药成分分析中的应用的研究与报道较少，因此本文就玄参中苯乙醇苷的分离与分析进行探讨，旨在为高效逆流色谱技术的应用价值提供有力依据，具体报告如下。 
　　1材料与方法 
　　1.1试验试剂本文选用的玄参为北京同仁堂药店（成都分店）生产的炮制品，醋酸乙酯为色谱纯（美国Honeywell公司）、正丁醇为色谱纯（美国Honeywell公司），乙醇为色谱纯（美国Honeywell公司），水为超纯水（由超纯水发生仪制造）。正己烷为分析纯（成都长江化工试剂有限公司）。 
　　1.2试验仪器高效逆流色谱仪为英国Dynamic extraction公司生产，逆流色谱泵为德国KNAUER公司生产，型号为Smartline100。检测器为紫外检测器，德国KNAUER公司生产。本文中高效液相色谱实验则采用安吉伦公司生产的Agilent2100高效液相色谱仪，检测器为DAD，色谱柱为ODS-C18（色谱柱参数为150mm×5mm，5um），质谱分析仪使用Thermo Fisher公司生产的API 4000 Qtrap串联四级杆质谱仪。 
　　1.3样品制备方法对本文选取的玄参药材称取其粉末500g，使用1500ml乙醇（80%）进行浸泡，并于室温下提取，连续提取5次，每次提取时间为12小时。将提取液过滤后，将滤液合并，并将滤液进行减压回收至体积为300ml。将减压回收获得的水液部分使用正己烷进行脱脂处理，共处理2次，每次使用300ml的正己烷。处理完毕后将正己烷弃去，剩余水层使用水饱和的正丁醇再萃取5次，每次使用300ml的正丁醇。将正丁醇层合并，并减压回收至干燥。由此获得的正丁醇提取物约6g，从中取近150mg供逆流色谱分析用。洗脱溶剂为醋酸乙酯-乙醇-正丁醇-水。将流出物使用HPLC-MS进行分析。 
　　1.4高速逆流色谱溶剂的选择在进行溶剂选择的过程中，取1mg正丁醇提取物分别置入6个试管中，将固定相与流动相均加入2ml至相应试管中，涡旋60s后静置1分钟。分层后取上层溶剂100ul与下层溶剂100ul，蒸干后使用甲醇500ul进行溶解，过0.45um滤膜。本文选用的溶剂系统分别自6种溶剂系统中筛选得出，该6个溶剂系统分别为：醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（4：0.6：0.6：5）、醋酸乙酯-乙醇-水（5：0.5：4.5）、醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1：1：0.1：2）、正己烷-醋酸乙酯0正丁醇-乙醇-水（0.5：0.5：1：0.1：2）、醋酸乙酯-正丁醇-水（4：1：5）[3]。通过对比化合物在不同的溶剂中的K值可得，醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水（1：1：0.1：2）能够大致满足HPCC的分配系数要求（0.5-2.5），因此以此作为溶剂体系使用。 
　　1.5高效液相色谱分析条件本文中HPLC采用二元泵梯度洗脱，流动相A为乙腈、B为0.5%醋酸水溶液。洗脱程序如下：0-1min，90%B；1-30min，70%B；30-35min，30%B；35-40min，90%B。流速设定为0.8ml/min，DAD检测波长设定为320nm。柱温箱设定温度为25℃，进样量为10ul。 
　　1.6质谱分析条件本文MS质量范围设定为50至2000，采用负离子模式，流速为5ul/min，ESI：4kV，CAD：N2，CUR：He，毛细管温度：200℃。 
　　2结果与讨论 
　　2.1高效逆流色谱分离结果溶剂体系达到平衡后，将上层液作为固定相使用，泵入螺旋管中，泵入速度为9ml/min。将逆流色谱的转速调节为1500r/min。再将水液泵入螺旋管中，速度为3ml/min。当流动相流出且两相平衡后，将事先制备好的玄参提取物注入至样品管中，通过分离后将相同的组分峰合并。所得纯化物通过HPLC-MS分析可得，与麦角甾苷标准品出峰位置相比，峰1与峰3均可能为麦角甾苷峰，而利用该两种化合物在质谱中的碎片离子特征最终可以判断，本文所得峰1为麦角甾苷峰，通过计算其纯度为95.0%。而通过与安格洛苷C标准品出峰位置相比，本文所得峰6为安格洛苷C，通过计算其纯度为92.0%。 
　　2.2讨论本文采用高速逆流色谱技术对中药中常用的玄参中的苯乙醇苷类物质进行分析与分离，在极短时间内即得到了分离纯度较高的麦角甾苷与安格洛苷C。由此可见，高速逆流色谱技术是针对中药成分分析与分离的良好方法，具有准确性、灵敏度、分析速度均较高等优点。随着科技的进展，高速逆流色谱技术的分离与分析技术将不断得到改进与完善[4]，因此本文认为，高效逆流色谱对于中药成分的分析具有更加广阔的前景与更加重要的应用价值，值得进行推广与应用。