六、Caspase-3活性的检测 
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
　1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
　　方法：
　　收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
　　结果：[图8-1、图8-2]
　　2 荧光分光光度计分析
　　原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
　　结果：[图9]
　　3 流式细胞术分析
　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
　　结果：[图10]

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 
　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。
（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析
　　材料试剂：
FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。
　　仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计
　　方法：
　　1 悬浮细胞的染色：
　　（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。
　　（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min
　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图11]
　　2：贴壁细胞的原位染色
　　（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到
50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。
　　（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。
　　（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微
镜观察TFAR19在细胞中的定位。
　　结果观察：[图12]
　　3：临床病理切片的染色、检测。
　　4：原代细胞的培养、检测。
　　5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病
1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。
　　材料和试剂：
　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
　　2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）
　　4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释
　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
柠檬酸 0.51g 
DDW 100ml
　　6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA 
Reader（OD490nm），洗板机 
　　操作步骤
　　1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。
　　2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
过夜。
　　3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。
　　4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
　　5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。
　　6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。
　　7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

◆ 细胞凋亡与肝病（一篇综述）

摘要：细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀。细胞凋亡偏重于凋亡小体的形态学的变化过程，并且可见于许多非生理状态，如疾病所引起的细胞凋亡和抗癌药物所引起的癌细胞死亡等，而程序性细胞死亡则偏重于其分子生物学和生理性功能，一般指生理性死亡。近年来有关肝病凋亡的论文发表量日益增多，本文就此进行综述。
一 、细胞凋亡的特征和检测方法
细胞凋亡在形态学上有四大特征：1）、细胞变圆，2）、胞浆起泡，3）、核固缩，4）、凋亡小体形成。形态学观察到凋亡小体是细胞凋亡的金标准，但此法并不敏感。（1）琼脂糖凝胶电泳对凋亡细胞基因组进行分析发现其DNA片段呈180-200bp的阶梯状的电泳条带。检测出这种典型的电泳条带是细胞凋亡的可靠指标。（2）近年来用于检测细胞凋亡的技术还有 TUNEL 法，通常认为其对细胞凋亡数量的估计过高。（3）因此在研究细胞凋亡时应尽可能的做琼脂糖凝胶电泳作为对照。另外还有流式细胞仪法测凋亡细胞峰法，通常认为它可以测定细胞凋亡的数量，并能够将坏死细胞、活细胞区分开来，是一种比较好的检测方法。可进行定量半定量的分析。（4） 
在肝脏凋亡小体被认为就是Councilman 小体、嗜酸性小体和固缩坏死。（5）并且发现肝脏凋亡发生迅速，可在几分钟、几小时内完成。通常凋亡细胞的清除是一个不伴有炎症的过程，因为细胞内的内容物被膜包裹形成凋亡小体而被枯否细胞、临近的肝细胞清除，细胞内的酶不外溢。这通常是对的，然而肝细胞的凋亡并非人们所想象的那样隐蔽而不容易被发现，在肝细胞的凋亡过程中可以检测到细胞内酶，并且当凋亡的肝细胞的数量超过肝组织的清除能力时，组织结构的丢失将会发生炎症，因此细胞凋亡在过去认为由细胞坏死触发的许多疾病中可能起重要作用。（6）
二、细胞凋亡的机制
在凋亡的过程中，凋亡启动阶段可以与凋亡执行阶段区分开来，在执行阶段 Caspases( 一组新的特异性水解底物天冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶家族)，可以依次激活来水解细胞和裂解一些关键的蛋白。Caspases通常以酶原Procaspases的形式存在于细胞胞浆内，需要蛋白酶先将其裂解为有功能的蛋白酶的形式才可发挥作用。并且现在认为Procaspases具有Caspases的活性，但其活性较Caspases为低。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性。所以Procaspase-8相互聚集时可以自我激活或相互激活为Caspase-8。Procaspases的相互聚集可由结合调节分子介导,如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs与Fas 和p75NGF 受体死亡区域具有相似的结构（6个折叠闭环，两歧性反向平行的α螺旋）。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”来激活 Caspases。之后Caspases可将蛋白从天冬氨酸盐羟基端一分为二。同时Caspases自身也是通过对其天冬氨酸残基进行裂解而激活。通常认为Caspases是通过其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的过程会导致Caspases的级联放大反应。Caspases(-3，-6，-7)被认为是Caspases中下游的Caspases，并且是分解底物的关键酶，是细胞凋亡的执行者。近来已发现两条激活Caspases的通路。一条涉及到死亡因子和死亡受体，另一条与线粒体功能障碍有关。(7)
死亡受体是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的成员。到目前为止共发现8种死亡受体，其中TNF受体1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又称CD95/APO-1）白被研究的最多，它们均通过其配体而被激活起作用。Fas和TNF-α可以动员细胞内不同的死亡复合体伴随的调节蛋白和procaspases 而活化死亡复合体，然后由死亡复合体激活一系列的上游Caspases，最主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶来执行促使细胞凋亡的作用。(7、8)
在第二条通路，细胞应激可以促发细胞色素C从线粒体上脱落，这通常可能是通过线粒体内膜的通透性改变而介导的。脱落的细胞色素C与　Apaf-1结合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases执行促使细胞凋亡的作用。(7)近来的资料表明线粒体和死亡复合体可以通过Bid蛋白联系起来，Caspase-8激活Bid蛋白，Bid蛋白随后可以诱导线粒体释放细胞色素C。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一员。目前还发现其它几种胞浆蛋白参与细胞凋亡的调节，主要是 Bcl-2的家族成员。目前在哺乳动物中已鉴定出至少１５种Bcl-2蛋白。它们可以分成两大类：促进细胞凋亡的，如Bax、Bak、Bok Bcl-xS、Bag、Bid、Hrk、BNIP3、BimL、EGL、Blk和Bad；抑制细胞凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1、Brg-1、和A1。(9,10)促进和抑制细胞凋亡的Bcl-2家族成员能结伴形成同源或异源二聚体。抗细胞凋亡的Bcl-2家族成员可以与线粒体结合抑制其释放细胞色素C，发挥抗细胞凋亡的作用。(11)已有的研究表明当Bcl-2/Bax>Bax/Bax时，细胞趋向于存活，当Bcl-2/Bax〈Bax/Bax时，细胞趋向于凋亡。尽管Bcl-2家族成员在调节凋亡中的确切作用不十分清楚，但Bcl-2家族之间的相互平衡最终决定凋亡刺激因素是否导致细胞发生死亡。(1)
三、细胞凋亡在肝病发病中的作用
１　酒精性肝病
到目前为止仅有有限的关于细胞凋亡在酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）发病中作用的报导。但是细胞凋亡在ALD发病中的作用却日益明朗化。事实上凋亡在ALD中的表现形式是嗜酸性小体，而且凋亡的标志物和Mallory小体可以在ALD 的肝细胞中同时观察到，提示这些细胞在组织中是通过凋亡的形式被清除的。同时在实验性ALD也可发现肝细胞凋亡，长期给予酒精的小鼠肝细胞内可见凋亡小体的数量明显增多，主要集中在肝小叶中央静脉末端的周围，这些病变在终止酒精给予后可逆。另一研究表明伴有肝损伤（如脂肪肝或肝炎症侵润）的酒精饲养大鼠肝细胞凋亡细胞数量增加。潜在的肝病理状态，使肝细胞更易于发生酒精诱导的肝细胞凋亡，这在肝铁超负荷时可以见到，而肝铁超负荷可见于许多酒精性肝病患者。在一个研究肝铁影响的大鼠模型中，在这些动物中凋亡细胞的数量超过了肝铁储积的作用，提示尚有其它的途径参与肝细胞凋亡。
酒精导致得肝损伤被认为与氧化应激导致的活性氧中间产物有关。在急性酒精中毒导致谷胱甘肽缺乏的大鼠模型中可见到许多凋亡的肝细胞。伴随着氧化应激在酒精导致得肝损伤中的作用，抗氧化剂在同一动物模型中可以减少凋亡细胞的数量。活性氧中间产物和脂质过氧化的形成被认为与细胞色素P450 2E1(CYP2E1)有关，而CYP2E1在肝细胞内大量表达。在导入CYP2E1表达的肝细胞中，由活性氧中间产物介导的脂质过氧化和随后在那些富含花生四烯酸的肝细胞中可见到细胞凋亡。同样通过导入Bcl-2可以阻止由CYP2E1介导的肝细胞凋亡。另一研究在有明显炎症和脂质过氧化的实验性ALD模型中发现Bcl-2 蛋白表达增加。因此肝细胞通过表达抗凋亡的Bcl-2蛋白可能是其抵抗酒精诱导的肝损伤的一种保护机制。
氧化应激也被认为与Fas系统相关，在酒精性肝损伤的病人中，肝细胞Fas配体mRNA转录增多，体内Fas配体可能是由活性氧中间产物诱导产生的。由于肝细胞可表达Fas受体，这些发现提示肝细胞可能通过旁分泌或自分泌的机制来介导自身的死亡。这种由酒精诱导肝损伤的潜在尚未完全阐明的重要机制被称为“fractricide”.
其它的几种细胞因子也可以参与酒精导致的细胞凋亡。纤维原性生长因子，转化生长因子(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)可诱导培养的肝细胞发生凋亡，在ALD的进展中可能具有双重作用：1）促进纤维化，2）通过凋亡杀死细胞。另外TNF-α1活性在临床ALD病人中和实验性ALD大鼠的肝细胞中表达均增强。慢性酒精消耗也可使肝细胞TNF-α1表达增加。总之，在慢性酒精消耗TNF-α1表达上调使肝细胞易于发生由这些细胞因子诱导的细胞凋亡，提示TNF-α1在ALD发病的病理生理中其重要作用。( 以上参考文献2，6，12，13，14，15，16，17)
2 病毒性肝炎
研究表明肝细胞凋亡在病毒性肝炎中起重要作用。病理形态学研究表明人肝炎中的确存在死亡的凋亡细胞，事实上在病毒性肝炎中可以经常观察到肝细胞以凋亡的行式被清除掉，病毒感染伴随凋亡被认为是由细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）作用的结果。CTL在识别病毒抗原是诱导自身表达Fas配体，并与靶细胞表面的Fas结合，启动凋亡信号，活化细胞死亡程序，使细胞死亡。已有的资料提示有几种不同的凋亡通路参与了肝细胞的凋亡，包括Fas系统、TNF-α系统、Perforin/Granzyme系统。
对于细胞凋亡在病毒性肝炎中的作用仅有有限的资料。小样本的资料研究表明在三例爆发性乙型病毒性肝炎中Fas蛋白表达增多。TUNEL分析表明大多数肝细胞呈阳性，提示Fas系统介导的凋亡参与急性肝炎的发病。
HBV和HCV是慢性肝病的主要致病因素。这些病毒感染使肝细胞易于发生凋亡，也可以通过model和病毒蛋白抑制凋亡。例如在小鼠肝细胞系中，TNF-α只能诱导高度表达HBV的肝细胞发生广泛的凋亡。感染HBV的肝细胞对促进凋亡因素的敏感性增高被认为与HBV的X-基因产物有关；同样HCV感染的肝细胞，HCV的病毒核心蛋白可以与TNF-αR1的胞浆内区域结合，这种相互作用在小鼠和人肝细胞株均可通过TNF信号转导系统介导而促进肝细胞凋亡。HBV、HCV感染肝细胞凋亡的敏感性增高的机制是不十分清楚的，但可能与TNF-αR1表达上调无关。为了完成自身的复制和阻止感染的肝细胞被清除，病毒同时发展了阻止凋亡的机制，这可以从HCV的NS3蛋白可抑制放线菌素诱导的肝细胞凋亡中得到例证。病毒蛋白对凋亡的总体作用似乎与凋望刺激物、细胞内容物和不同的病毒蛋白表达的相对水平有关。
目前的临床研究资料提示在HBV和HCV感染的肝细胞中有免疫介导的凋亡途径激活。在慢性HCV感染的40位病人的肝组织中用免疫组化的方法研究发现其Fas 和HCV核心蛋白抗原的表达明显高于健康者。在慢性HBV感染的病人也可以观察到其Fas系统激活，并且Fas不但在肝细胞中高度表达，而且在分子水平上上调。有趣的是Fas mRNA主要在淋巴细胞浸润的区域被发现，这也支持CTL介导感染肝细胞通过Fas系统发生凋亡。因此人们推测以凋亡的形式清除肝细胞可能是：1）感染了肝炎病毒的肝细胞表面除了病毒抗原和MHCⅠ类抗原外，Fas表达也增多。2）肝炎病毒抗原和MHCⅠ类抗原与CTL表面的T细胞受体结合，活化CTL诱导其表达Fas配体。3）表达于CTL表面的Fas配体与肝细胞表面的Fas结合，传导死亡信号，激活caspases 等使肝细胞死亡。（以上参考文献2，6，12，14，17，18，19，20）