一文了解外泌体在肺癌中的研究进展
肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌类型的85%以上，死亡率高达80%～90%。由于缺乏有效的早期诊断筛查方法，70%肺癌患者确诊时已是晚期，5年生存率仅为16%～18%。因此，寻找新的生物标志物和靶向治疗的新靶点对肺癌的早期诊断和临床治疗至关重要。近年来，针对外泌体的研究越来越多，大量研究发现外泌体通过与肿瘤微环境相互作用介导肿瘤细胞的生长和转移、肿瘤免疫调节、放化疗抵抗等多方面影响肺癌的发生、发展。此外，外泌体可为肺癌的早期诊断提供重要信息，具有成为肺癌肿瘤标志物的潜力。因此，肺癌外泌体的研究将为肺癌的诊断和治疗提供新思路。本文主要从外泌体的生物学功能和临床应用方面的研究进展作一综述。
外泌体概述
外泌体是由多种活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制而形成的具有脂质双层膜结构的纳米级微小囊泡，其密度为1.13～1.21g/mL，直径约为30～100nm。外泌体最早是在1983年由Johnstone RM等研究羊成熟网织红细胞过程中囊泡的形成时发现的。外泌体在电镜下观察常呈杯型或双凹碟型，在人体体液中常呈球型，广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、乳汁、脑脊液等多种体液中。通常采用超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、色谱法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等方法提取得到外泌体。外泌体含有大量生物活性物质，如蛋白质、核酸、脂质、病毒和朊病毒等。外泌体中脂质成分主要包括胆固醇、鞘磷脂、卵磷脂、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经节苷脂、聚甘油磷脂、饱和脂肪酸等，这些脂质结构具有提高细胞膜稳定性的作用。外泌体中含有丰富的蛋白质，主要包括膜运输和融合相关的蛋白质如Rab蛋白、GTP酶、膜联蛋白等；细胞骨架成分如肌动蛋白、微管蛋白等；四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等；与外泌体形成相关的蛋白质如肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、内体分拣转运复合物（ESCRT）等；热休克蛋白如HSP70、HSP60和HSP90。此外，外泌体还包含与细胞来源和组织类型相关的各种特异性蛋白，如主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCI）、MHCⅡ、细胞黏附分子等。除蛋白质和脂质外，外泌体还包含大量的核酸，如信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（LncRNA）和DNA等。这些成分在肿瘤微环境内相互作用，在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。
外泌体在肺癌中的生物学作用
2.1外泌体在肺癌肿瘤微环境中的作用
2.1.1外泌体介导肿瘤血管的生成
肿瘤血管是肿瘤细胞生长和发展过程中营养物质的主要来源。大量研究表明，肺癌细胞来源外泌体（LCC-exosome）含有血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）、miRNA等多种细胞因子。LCC-exosome将自身所含的细胞因子释放到肿瘤微环境中，通过不同的途径作用于内皮细胞膜表面受体，促进肺癌新血管的形成，进而促进肺癌细胞的增殖、提高肺癌的侵袭性和转移力。通过体外实验发现人类肺癌细胞A549来源的外泌体分泌的分拣蛋白，与酪氨酸激酶受体B和EGFR形成TES复合物在内皮细胞的激活和迁移中起着作用，并在肺癌血管的生成中发挥作用。Kosaka N等发现LCC-exosome释放的miR-210通过分泌中性鞘磷脂酶2（NSMASE2）抑制特异性靶基因，从而促进肿瘤血管的生成。低氧状态下诱导A549肺癌细胞向周围内皮细胞释放miR-494和外泌体，通过抑制PTEN和Akt/eNOS途径的激活，促进肿瘤血管的生成。另一项研究发现LCC-exosome分泌的miR-210，通过下内皮细胞中酪氨酸受体激酶A3的水平，促进肿瘤血管生成。由此可见，LCC-exosome可以通过多种途径介导肿瘤血管的形成，进而调控肿瘤微环境，促进肺癌的生长和转移。
2.1.2外泌体在上皮细胞-间充质转化形成中的作用
上皮细胞间充质转化（EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，主要的特征有细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架等，EMT是一种能导致肿瘤细胞迁移、侵袭和转移的生物学过程。Rahman MA等研究发现高转移性的肺癌外泌体可诱导正常支气管上皮细胞表达波形蛋白，进而通过波形蛋白来驱动正常支气管上皮细胞发生EMT，使得受体细胞获得迁移、侵袭和增殖能力。研究发现肺腺癌A549细胞来源的外泌体释放的Rab3D蛋白和转化生长因子-β（TGF-β）能通过不同途径促进EMT，进而增强了肺癌的侵袭性和转移性。
2.1.3外泌体参与肿瘤相关成纤维细胞形成
肿瘤相关成纤维细胞（TAF）由肿瘤基质中固有的纤维细胞转变形成，是肿瘤微环境的主要基质细胞。研究表明，TAF不仅是肿瘤生长的“土壤”，更能分泌多种细胞因子，与肿瘤微环境中的肿瘤细胞及其他间质细胞相互作用，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。通过体外实验发现肺癌A549来源的外泌体表面具有的HSP70能够刺激肺正常间充质干细胞（MSC）产生一种促炎性间充质干细胞，进一步触发NF-κB通路快速激活核转录因子-κB（NF-κB）/Toll样受体2（TLR2），使IL-6、IL-8、MCP-1分泌增多，促进肺癌的生长。研究还发现人和鼠肺癌模型细胞来源的外泌体能激活成纤维细胞和内皮细胞，并诱导基质细胞表达血管生成相关因子如IL-8、VEGF、LIF、OSM、IL-11和MMP-9，从而促进肺癌微环境血管生成。因此，LCC-exosome参与肿瘤相关成纤维细胞形成，促进肿瘤细胞的发生、侵袭及转移。
2.2外泌体参与肿瘤免疫调节
大量研究表明，外泌体在抑制免疫反应或免疫逃逸过程中起到重要的作用。外泌体包含有一些肿瘤特异性抗原，这些特异性抗原通过激活抗原递呈细胞（APC）如树突状细胞（DC细胞），引起T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。Huang SH等研究发现LCC-exosome携带的表皮生长因子受体（EGFR）可诱导产生免疫耐受性树突状细胞，进而生成特异性调节性T细胞（TREG），TREG具有抑制CD8+T细胞抗肿瘤功能，从而影响肺癌的发生发展。LCC-exosome分泌的miR-21和miR-29A，通过与Toll样受体（TLR）家族、TLR7和人类TLR8受体结合，触发TLR介导的NF-κB信号通路活化，最终导致肿瘤生长和转移。研究证实，外泌体中的配体如MICA、MICB等通过与NKG2D（MEMBERD）受体结合，使NKG2D受体表达下调，抑制淋巴细胞功能，最终导致肿瘤细胞的免疫逃逸。以上结果表明，LCC-exosome可介导肿瘤免疫调节，参与免疫逃逸，促进肺癌的发生发展。
2.3外泌体参与肿瘤放化疗抵抗
肿瘤化疗耐药和放疗耐受及抵抗是导致肿瘤侵袭、转移和复发的重要原因。研究表明，LCC-exosome在肺癌放化疗抵抗过程中发挥着重要功能。Xiao X等研究发现当肺癌A549细胞暴露于顺铂（DDP）后，外泌体分泌水平升高，A549细胞释放的外泌体降低了其他A549细胞对顺铂的敏感性，同时其他A549细胞分泌的外泌体增加了A549细胞对顺铂的抗性。Qin X等研究发现肺癌细胞中提取的外泌体使顺铂对其他癌细胞具有抗性，A549细胞外泌体分泌的miR-100-5P的下调被证实参与了顺铂的抵抗。研究还发现使用吉非替尼处理过的PC9人肺癌细胞系所产生的外泌体降低了顺铂的抗肿瘤作用。此外，Tang Ｙ等研究发现肺癌患者接受60Gy放射治疗后含miR-208A的外泌体表达水平升高，进一步激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，最终导致肺癌放疗抵抗。以上研究表明，外泌体及其分泌的蛋白质、miRNA通过不同途径影响着放化疗疗效。
外泌体在肺癌诊断中的作用
随着对肺癌诊断方法研究的深入，目前国内外正在广泛研究血清生物学标志物联合低剂量螺旋CT（LDCT）的肺癌诊断策略，通过血清生物学标志物筛查肺癌是目前研究的热点和趋势。研究表明，外泌体分泌的miRNA和蛋白质可作为肺癌临床应用中较理想的新的生物学诊断标志物。Giallobardo M等利用定量聚合酶链反应（qPCR）分析NSCLC患者血液中提取的外泌体所分泌的8个miRNA（miR-30B、-30C、103、-122、-195、-203、-221和-222）均与NSCLC相关；Cazzoli R等采用qPCR研究发现肺腺癌患者血液提取的外泌体所携带的4种miRNA（hsa-miR-378A、-379、-139-5P和-200B-5P）较健康吸烟者表达水平高，6种miRNA（hsa-miR-151A-5P、-30A-3P、-200B-5P、-629、-100和-154-3P）在肺腺癌中表达水平明显高于肺肉芽肿患者；Rodriguez M等研究发现肺癌患者血液中外泌体含有的miR-122-5P表达量高于支气管肺泡灌洗液（BALF）所分离的量。Vanni I等研究发现肺癌患者血液外泌体来源的miR-25和miR-223的表达水平较正常人升高，而let-7F、miR-20B和miR-30E-3P的表达水平前者较后者明显降低，这种差异性表达为肺癌的诊断带来潜在应用价值。此外，外泌体蛋白质也可以作为肺癌标志物。Huang SH等研究发现从NSCLC患者组织提取分离的外泌体蛋白质中约80%含有EGFR，在肺部慢性炎症患者中只有约2%的外泌体蛋白含有EGFR；另一项研究采用EV阵列分析法研究表明外泌体蛋白可作为晚期NSCLC的潜在诊断标志物。通过免疫印迹和免疫组织化学法研究发现肺癌患者尿液来源的外泌体中的人富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是NSCLC非侵入性诊断的候选生物学标志物。Ueda K等通过对1369个外泌体蛋白进行质谱定量分析，发现CD91可作为鉴别肺腺癌特异抗原的外泌体，CD91联合癌胚抗原（CEA）可作为肺癌诊断标志物，两者联合检测的灵敏度和特异度均高于单独检测CEA。以上研究表明，外泌体的相关miRNA和蛋白质检测将为肺癌患者的早期发现、早期诊断提供更可靠的依据。
外泌体在肺癌治疗及预后评估中的作用
大量研究已经证明外泌体的相关研究对肺癌的治疗起着重要的作用。目前存在四种潜在的治疗策略：①抑制外泌体的产生或分泌，降低外泌体含量。MARLEAｕAM等利用一种AETHLONADPT血浆置换技术，将含有外泌体的血液过滤，发现针对性减少外泌体的含量可能成为治疗肺癌新技术；②外泌体可作为抗肿瘤疫苗。研究表明DC细胞来源的外泌体（DEX）可激活CD4+和CD8+T淋巴细胞产生抗肿瘤作用。因此，外泌体可作为疫苗用于肺癌的治疗新手段。研究发现在晚期NSCLC患者中，DEX疫苗是可行的，其治疗耐受性良好。脂质体疫苗BLP-25、TG4010等可能在肺癌免疫治疗中起作用，需进一步进行实验验证。BESSEB等采用DEX疫苗治疗NSCLC患者进行Ⅱ期临床试验，证实了在晚期NSCLC患者中，DEX能够增强自然杀伤细胞（NK）的抗肿瘤作用；③外泌体可作为药物传送载体。外泌体膜与亲本细胞膜的组成相近，可直接与靶细胞膜融合，同时具有稳定性、细胞靶向性，可作为药物传送载体的理想颗粒。Aqil F等将组装的南蛇藤素-外泌体复合体（EXO-CEL）在A549和H1299肺癌细胞系中进行体外实验发现外泌体复合物抗肿瘤效果较好。通过实验组装形成的外泌体-紫衫醇复合物药效高于单独应用paclitaxel；④外泌体可作为肺癌治疗新靶点。研究发现外泌体let-7的表达水平与肺癌的发生发展具有显着的相关性，提示外泌体let-7可作为肺癌治疗的新靶点。此外，研究表明外泌体在肺癌的治疗中具有潜在的预后评估价值。Munagala R等通过检测小鼠肺癌模型中肿瘤和血清外泌体的miRNA在原发和复发性肺癌中的表达水平变化，发现复发性肺癌中外泌体miR-21和miR-155显着升高，证明这两种外泌体miRNA的表达水平与肺癌复发风险具有一定的相关性。研究还发现外泌体miR-29A-3P和miR-150-5P的表达水平具有预测肺癌放疗相关毒性的价值。
外泌体与循环肿瘤细胞（CTC）、血浆游离DNA（cfDNA）同为液体活检的重要组成，液体活检将为肿瘤的精准医疗开辟新纪元，外泌体的研究也越来越热门。尽管目前对外泌体在肺癌生物学作用、诊断、治疗、预后评估中的应用价值已有大量的研究和探索，然而外泌体促进肺癌发生发展的机制还需要进一步深入的研究，仍需要对外泌体作为肺癌诊断标志物进行大样本的验证和谨慎分析确定。随着对外泌体生物学结构及功能的进一步研究，以及更深入的理解外泌体在肺癌发生发展中的生物学机制，相信外泌体在肺癌的诊断和治疗上将有广阔的前景，有望研发出新的抗肿瘤靶向药物及临床肿瘤干预的一系列措施。
