使用层粘连蛋白的非包被法对人hPSC进行有效的贴壁培养

2016年京都大学Miyazaki团队发现在人hPSC传代培养期间，可以向细胞悬浮液中添加层粘连蛋白iMatrix-511，这样可以省略在培养皿上预包被的过程。在此之前，都公认必须要花费数小时对培养皿进行预包被以增强细胞附着性。另外，使用非包被法添加iMatrix-511，能减少这种细胞外基质的使用量，但功效却与对培养皿采取预包被法时相同。最后，该团队还证实了iMatrix-511的添加还能支持hPSC单细胞传代的长期维持。通过使用非包被的iMatrix-511，hPSC的扩增可以变得更加有效，成本更低且更省时省力。

实验方法

将hPSC铺在含有10μM Y-27632和培养基质的培养基中。对于使用iMatrix-511非包被法的一般培养，iMatrix-511的浓度为0.25μg/cm²。例如，在无任何包被的6孔板的单孔中，加入含5μL 0.5mg/mL iMatrix-511母液的2mL细胞悬浮液，以进行细胞培养。接种后，以TeSR-E8和StemFit AK03培养基培养hESC H9细胞系和hiPSC（人体诱导多能干细胞）253G1细胞系。每4天用0.5×胰酶和5mM EDTA/DPBS组成的细胞消化液在室温下处理细胞5min来进行传代。培养基的体积为200μL/cm²。

在非包被法下生长的hPSC的特征

实验团队通过一系列方法评估了在非包被法下长期培养的hPSC是否正常。使用iMatrix-511的非包被法，hPSC能连续传代，并传代超过10次。与预包被法下培养的细胞类似，在非包被法下培养的hPSC增殖良好并保持正常的细胞形态。此外，它们能高度表达代表性的未分化细胞表面标志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81，并且不表达SSEA-1，表明了其持续的未分化状态与以常规的预包被法下生长的细胞相似（图1a）。团队对非包被法生长的hPSC进行了qPCR分析，也证明了hPSC处于未分化状态。与预包被法相比，两者的未分化标记基因的表达水平很相似（图1b），表明了非包被法和预包被法中生长的hPSC的未分化状态几乎没有差异。核型分析显示，非包被法不影响hPSC的稳定性（图1c，补充图3）。这些结果表明即使在连续传代培养后，非包被法也能维持hPSC的未分化状态。最后，团队评估了在非包被法中生长的hPSC分化成不同细胞系的潜力。hPSC可正常形成胚状体。通过与诱导前的基因表达进行比较，胚状体对于三胚层特异的标记基因的表达会高度上升，表明它们保持着分化潜力（图1d）。因此，团队得出结论，在非包被法下生长的hPSC能维持其多能性，并且非包被法可以应用于hPSC日常的连续传代培养。

图1. 在非包被法下生长的hPSC的特征。（a）具代表性的未分化标记物的流式细胞分析。途中灰色阴影区域为阴性对照。（b）未分化标记基因的qPCR分析。图中显示了非包被法下生长的经29次传代的hPSC与在预包被法下生长的经10次传代的hPSC的相对表达。（c）G带正常核型分析。hESC H9细胞系具有正常的核型（46，XX）。（d）用于胚状体分化的标记基因的qPCR分析。hPSC在非包被法下培养，然后用14天将其诱导成胚状体。通过分析TaqMan hPSC Scorecard 序列检测的单组数据，将具代表性的分化标记基因的表达与胚状体形成前该基因的表达进行比较，结果表示如图所列的基因组的表达有着超过两倍的增长。数据是从在非包被法下生长了10代的hPSC中收集的。

结论

iMatrix-511在作为培养基补充剂，添加时能有效地支持细胞粘附，但它可以不通过预包被法来实现。与其他的基质蛋白不同，与预包被法相比，非包被法中iMatrix-511以低得多的浓度来支持细胞粘附和长期扩增。这种使用iMatrix-511的新方法可以降低hPSC维持的成本和时间。

参考文献：
Miyazaki, Takamichi , et al. "Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner." Scientific Reports 7(2017):41165.