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Digital PCR 技术的发展与应用（一）

2020.4.20

dPCR发展历史

1992年，Sykes等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞，检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则：有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理，为以后dPCR的发展奠定了基础。

1997年，有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应，可以对模板分子进行定量，验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子，尤其在微小的反应体系中，发展了单分子定量技术，为dPCR单模板扩增提供了技术支持。

1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他们在结肠癌患者粪便中检测KRAS基因突变时，首先把样本分配到384孔板中，然后分别用不同荧光检测突变基因和正常基因，通过计算突变基因和正常基因的比例来得出突变率。

2003 年 Dressman 等发明了一种BEAMing 方法(珠子、乳剂、扩增与磁力) 。BEAMing 将模板、引物、PCR 试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR 完成后，其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。

2006年 Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统。随后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪，2013年该公司又推出了升级型号QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统。

商业化数字PCR平台的概述

类型	供应商	生产时间	仪器型号	分液数目	特点
芯片式	Fluidigm	2006	EP1	36,960	基于集成流体通路芯片，快速准确地将流体分成独立的单元。操作耗时，反应成本高。
2006	BioMark HD	9180
Life Technologi-es	2009	Open Array	3072	反应重复的数量可轻松调整，以满足应用需求。样品之间完全隔离，防止交叉污染。反应的通量较低。
2009	QuantStudio 12K Flex	3072
2013	QuantStudio 3D	20,000
微滴式	Bio-Rad	2011	QC100	20,000	基于油包水技术，大量的微滴提供了足够的精确度，能准确测定样品拷贝数。可同时进行96个样本反应。
2013	QX200	20,000
RainDance	2012	RainDrop	10,000,000	皮升级反应微滴，提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品。

基本原理

dPCR的原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成上万个和数百万个PCR 反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，利用标记的探针检测特定的靶序列,通过读取荧光信号的有或无，计算两种信号类型的反应单元比例和数目，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。

根据数字PCR 反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。

不同于 qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，dPCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

根据大量独立反应单元实现方式的不同，dPCR又细分为基于液滴式微流控（droplet microfluidics）的微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和基于芯片式微流控的微阵列芯片式数字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。

微流控芯片数字PCR

随着微流芯片技术的发展，数字 PCR 借助微流芯片，可以把样本准确并且快速的分成若干个独立的反应单元，各个单元之间互不影响，可以多步反应同时进行。提高反应通量的同时也降低了反应消耗成本。目前Fluidigm公司的Bio-Mark ^TM 基因分析系统，Life Technologies公司QuantStudio ^TM 3D数字 PCR系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR系统。