动物、植物、微生物中提取高质量的基因组DNA（二）
5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
4. 同本节（一）中步骤3-13操作。
2. 从动物组织提取基因组DNA
一、材料
哺乳动物新鲜组织。
二、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤:
切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。
10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。
3. 细菌基因组DNA的制备
一、材料
细菌培养物。
二、设备
移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。
三、试剂
1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
四、操作步骤：
100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。
8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
4. 基因组DNA的检测
上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。
DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。
3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。
如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。
（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。
（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。
