实验材料 RTA 基因

试剂、试剂盒 结合（或漂洗）缓冲液生物素琼脂糖洗脱缓冲液

仪器、耗材 RNeasy™mini 试剂盒

实验步骤

这里介绍的方法概括了表达载体的构建以及筛选功能蛋白的 RIDS 循环系统的构建。

3.1 RIDS 表达载体的构建

首先，需要准备含编码 T7 启动子、蛋白质文库、连接子、RTA 和间隔区的 DNA 来构建 RIDS ( 图 13.2A )。13. 3.1.1〜13.3.3.3 部分详述了这个过程。尽管理论上用聚合酶链反应（PCR) 制备双链 DNA 是可行的，但是我们推荐用质粒来构建此 DNA，因为用 PCR 来连接不同部分（包括 T7 启动子、蛋白质文库、连接子、RTA 和间隔区)，很难保证不会引入非特异性扩增。在这个章节中，我们描述了构建 RIDS 载体的过程。由于采用标准的重

组 DNA 方法来构建载体，因为篇幅有限，DNA 的操作过程在此就不赘述了。

3.1.1 构建 pLRS 表达载体

首先，我们需要准备通用载体 pLRS，它像构建 RIDS 的 DNA —样，能编码 T7 启动子、蛋白质文库、连接子、RTA 和间隔区（图 13.2 A ) 。 这个载体是基于 pET30a 载体（Novagen ) 的表达系统。我们通过将 cDNA 文库或者随机文库插入到 pLRS 载体的位点可以很容易地构建 RIDS 蛋白质文库。

用 DNA 合成仪合成连接子片段，并通过 T7 启动子下游的 XbaI/XhoI 位点插入到 pET30a 载体中。连接子编码了  NheI、噬菌体 M13 基因 II 的甘氨酸/丝氨酸富集序列、NcoI、Bam HI、Pstl 和 XhoI ( 顺序从上游开始）。编 码 RTA 的 DNA 是通过 PCR 从 pUTA 质粒中（获赠于得克萨斯大学的 J.Robertus 教授）得到的，并且将其通过 NcoI/Bam HI 位点插入到甘氨酸/丝氨酸富集序列的下游。编码间隔区的 DNA 来源于噬菌体 M13 基因 HI，并且通过 Bam Hl/Pst l 位点插入到 RTA 的下游。DNA 的序列 ( 不包括插入的 RIDS 蛋白质文库序列）如图 13.2 B 所示。

T7 启动子和蛋白质文库第一个 ATG 之间的 71-mer 序列来自于 pET30a 载体。RTA 上游灵活的连接子对于初生蛋白折叠成正确的三维结构，去除蛋白质文库和下游 RTA 之间的空间阻隔是必需的。之前的研究表明，被选择的蛋白质/mRNA 量强烈依赖于这个连接子的长度、组成和序列 [ 6，16，17] 。在目前的研究中，我们用 44 个含有甘氨酸/丝氨酸富集序列的氨基酸作为连接子。

去除 RTA 的空间阻隔是非常重要的。这是因为，在 RIDS 中通过引进 RTA 基因来达到稳定 mRNA-核糖体-蛋白质复合体的目的。除了这个连接子之外，可读框 (ORF) 3' 端的间隔区也是非常重要的。这个间隔区作为锚来连接核糖体，必须有合适的长度才能占据核糖体的长通道 [ 18，19] ，并且允许初生 RTA 正确折叠而没有任何空间障碍 [ 20，21] 。已经有报道，C 端至少需要 20〜30 个氨基酸的间隔区来保持展示在核糖体上的酶的活性 [ 22，23] 。因此，核糖体展示系统上分离出的 mRNA 量会受到间隔子的长度，及其 3' 端二级结构的影响。我们在 ORF 的 3' 端分别引进一个长的和一个短的间隔区序列，比较它们在翻译和选择方面的影响。我们发现，在我们的系统里，长的间隔子（由噬菌体 M13 的全长基因 III 编码的 404 个氨基酸）对于翻译和选择是不合适的。

所以，在我们所有的实验中，我们用 121 个氨基酸的片段作为间隔子。

3.1.2 pStAv-R 和 pGST-R 载体的构建

为了校正提出的方法和 RIDS 的潜在应用性，我们在 DNA 文库中引进编码链霉亲和素或 GST 基因作为模式研究（图 13.3 A )。这些蛋白质经常被融合进新发现的蛋白质或者与之相互作用的分子上，成功地研究新发现的融合蛋白的功能性质[ 25〜28] 。链霉亲和素和 GST 分别结合到生物素和谷胱甘肽上，这种结合具有高亲和性和特异性。因此，分离和确认蛋白质-核糖体-mRNA 复合体可能是很容易的。

从 pSTA ( 冈山大学的 M.Sisido 教授所赠）和 pGEX-4T-3 ( AmershamBiosicences) 质粒上分别切除编码链霉亲和素和 GST 的 DNA。用 PCR 方法将这些片段进行扩增，并分别连接到 pLRS 质粒的 XbaI/NhI 位点中，构建成 pStAv-R 和 pGST-R 质粒。

编码链霉亲和素或者 GST 的 DNA 的序列如图 13.3B，13.3C 所示。

3.1.3 pStAv-mR 和 pGST-mR 质粒的构建

为了确认 RTA 有利于稳定核糖体复合体，在对照实验中，我们通过点特异突变的方法改变了 RTA 功能氨基酸，得到 RTA 的突变失活基因。步骤如下：第 177 位的谷氨酸突变成谷氨酰胺；第 180 位的精氨酸突变成组氨酸；第 208 位的谷氨酸突变成天冬氨酸。这 3 个氨基酸的突变完全抑制了 RTA 的活性 [ 29，30 ] 。为了构建 pStAv-mR 和 pGST-mR 质粒，每个质粒（pStAv-R 或 pGST-R) 都采取标准的方法用 RTA 突变体基因替代 RTA 基因 [31]，引物如下：5'-TTG  CAT CCA AAT GAT TTC AAAGC AGC  AC A  C T T  CCA  A T A T A T   TA G   GGA  G AA  ATG-3' ( 下画线为 E177A 和 R180H 突变），以及 5'-G A T   CCT  AGC  G TA  A T T   AC A  C T T  G AG  G AT  CCT  AGCG T A  A T T   AC A  C TT  GA-3' ( 下画线为 E208D 突变）。

3.2 选择功能性蛋白的 RIDS 循环

采取标准的重组 DNA 方法，在含有随机文库或 cDNA 文库（在我们的模式研究中，是 pStAv-R、pGST-R、pStAv-mR 和 pGST-mR ) 的 ORF 中，用 XhoI 酶切 ORF 的 3' 端产生线性 DNA。这个酶切反应是终止转录必需的。

3.2.1 DNA 文库到 mRNA 的转录

在 T7RNA 聚合酶的作用下，DNA 被转录，含有一个帽状结构类似物。在我们的模式研究中，在供应商（Epicentre  Technologies Co.) 的推荐下，用 T7 Ampliscribe™ 试剂盒转录 DNA。

( 1 ) 根据供应商的推荐，向 20 μl 转录混合物中添加 1 μg 线性 DNA。转录混合物含有 3 mmol/L 帽状结构类似物、7.5 mmol/L rATP、rCTP、rUTP；0.75 mmol/L rGTP；10 mmol/L 反应缓冲液以及 AmpliScribe T7 酶溶液。

( 2 ) 在 37°C 静置反应混合液 2〜4 h，产生各种 mRNA ( 我们将这些 mRNA 分别命名为：StAv-R、pGST-R、pStAv-mR 和 GST- mR)。

( 3 ) 在转录反应后，用 DNase I 完全消化模板 DNA，因为残余的模板 DNA 会影响后面的选择步骤。

( 4 ) 根据供应商（Qiagen) 的推荐，用 RNeasy™ mini 试剂盒纯化 mRNA。

3.2.2 核糖体-mRNA-蛋白质复合体的亲和选择和 mRNA 的分离

制备 RNA 编码文库（在我们的模式实验中，是 StAv- R、pGST- R、pStAv-mR 和 GST- mR) 和 Flexi 兔网织红细胞裂解系统（Promega; 见注 1)。

( 1 ) 向 40 μl 翻译混合物中添加 2 μg mRNA。翻译混合物含有 33 μl Flexi 兔网织红细胞裂解液、40 mmol/L  KCl、40 μmol/L 总氨基酸混合液、40 U Recombinant  RNasin 核糖核酸酶抑制剂（Promega)，用蒸馏水定容体积到 50 μl。不要添加 DTT 和 Mg2+ 离子（见注 1)。

( 2 ) 在 30°C 静置 20 min。在我们的研究中，3 种 mRNA 体系被翻译（每种体系用 2 μg RNA，它们分别是：以 1 :1 比例混合的 mRNA，以及作为对照的编码链霉亲和素或者 GST ( StAv-R 和 GST-R) 的 mRNA；见注 2）。

( 3 ) 翻译之后，添加 1 ml 适当的结合缓冲液 [ 见 13.2 ( 13 ) ] 和配基固定珠子。在我们的研究里，添加 10 μl 生物素琼脂糖或者谷胱甘肽珠子的终止液（见注 3)。

( 4 ) 在 4°C 静置 1 h，温和地搅拌有利于结合反应。尽管静置在室温下也是可以的，但是我们推荐 4°C。因为在反义转录 PCR (RT-PCR ) 里有时会检测到非特异性的结合(见注4)。

( 5 ) 在结合反应后，用 500 g 的转速离心 1 min 来沉淀配基固定珠子。

( 6 ) 去掉含有未结合 mRNA 和蛋白质的上清液。

( 7 ) 添加 200 μl 漂洗液 [ 见 13.2 (13)]，温和地混合 30s。

( 8 ) 用 500 g 的转速离心 1 min 来沉淀配基固定珠子。

( 9 ) 去掉含有未结合 mRNA 和蛋白质的上清液。

( 10 ) 重复漂洗步骤（7〜9 )  2 次或者 3 次。

( 11 ) 添加 100 μl 洗脱缓冲液 [见 13.2(16 ) ] ，室温用力地摇动 30 min，从沉淀配基固定珠子上分离出结合的 mRNA。

( 12 ) 根据供应商的推荐，用 RNeasy™ 试剂盒纯化洗脱下来的 mRNA，用真空泵浓缩纯化后的 mRNA。

3.2.3 反义转录

用 RT 进行反义转录反应。在我们的模式研究中，根据供应商的推荐，用 ReverTra  Ace  (Toyobo) 进行反义转录反应。

( 1 ) 将纯化后的 mRNA、4 μl 10 μmol/L RT 引物、每种 10 mmol/L dUTP 2 μl、4 μl 5X RT 缓冲液，用蒸馏水定容到 18 μl，根据供应商的推荐，不加 RNase 抑制剂和 ReverTra Ace。RT 引物用来（5'-G T G T A G C T T T G C A C A G T G G C -3' ) 识别 RTA 序列的上游部分。

( 2 ) 将混合物在 65°C 下放置 5 min 变性后，迅速放到冰上冷却。

( 3 ) 向混合物中添加 1 μl RNase 抑制剂和 1 μl ReverTra Ace。

( 4 ) 42°C 静置 1 h 进行反转录。然后 99°C 静置 5 min 将酶失活。

3.2.4 聚合酶链反应

用热稳定 DNA 聚合酶进行 PCR 反应。在我们的模式研究中，根据供应商的推荐，用 KOD Dash ( Toyobo) 进行 PCR 反应。

( 1 ) 将 20 μl cDNA、10 μl 10X PCR 缓冲液、每种 2 mmol/L dUTP 10 μl、1 μl 10 mmol/L RT ( 作为下游引物），以及 2 μl 10 μmol/L 上游引物，用蒸馏水定容到 99 μl，不添加 KOD Dash。上游引物（ 5'-AAT TTT GTT TAA CTT GAA GGA G-3'）用来识别 T7 启动子序列的下游部分。

( 2 ) 将混合物在 98°C 下放置 2 min 变性后，迅速放到冰上冷却。

( 3 ) 添加 0.5 μl KOD Dash。

( 4 ) 运行 PCR 程序（98°C 1 min；然后 98°C 10s，55°C 2 s，72°C 30s，循环 15〜30 次；最后 72°C 10 min )。98°C 静置 1 min。