病毒包装技术7——腺相关病毒(AAV)包装介绍
锐赛小课堂技术篇0702-113
摘要:
腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒， 因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。但是也可以通过新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。
1．简介
腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在缺少辅助病毒诸如腺病毒(Berns,1990；Muzyczka,1992；Berns和Giraud,1996)、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下(Yakobson等,1989),AAV能复制产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来(Kotin等，1990)。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，4680个核苷酸，在每个末端含有一个145个碱基末端重复序列(TR)（Srivastava等,1983）。TR序列折叠成发卡结构作为DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的唯一已知顺式作用元件。
重组腺病毒载体(rAAV)的构建通常涉及rep和cap基因的剔除和将感兴趣的转基因插入TR元件之间。关键的Ad辅助基因包括：E1a转录激活Ad以及AAV基因，E1b和E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，E2a表达一个ssDNA结合蛋白质促进AAV DNA复制，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译。
此繁琐过程的局限性阻止了rAAV广泛发展为基因治疗的载体。如上所述载体的生成总是导致载体的明显Ad污染，因此需要热处理和严格的纯化方法灭活和去除Ad病毒颗粒污染。尽管载体和包装质粒之间通常没有同源序列，但是经常产生野生型样有复制能力的AAV(rcAAV)(Allen等，1997；Wang等，1998)。已经进行了许多尝试改进rAAV载体的包装效率。它们包括：发展表达一些或所有包装所需的AAV基因的细胞系（Yang等,1994；Clark等,1995；Tamayose等,1996；Inoue和Russell,198），构建Ad辅助质粒能够用来替代Ad感染(Matsu***a等,1998；Xiao等，1998b)和发展重组Ad携带rAAV载体基因组(Gao等,1998)。
我们已经构建了新的辅助质粒，完全不用在rAAV包装过程中感染Ad。这些质粒含有Ad基因组的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。当转染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293细胞中，辅助质粒提供了一个有效的、无Ad污染的包装系统。我们用此新系统所产生的rAAV滴度与大多pAAV/Ad包装质粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外，Ad再也不能产生，有复制能力的AAV在任何载体制备过程中尚未发现。
2.材料和方法
2.1. 质粒、细胞和病毒
一个rAAV载体质粒，表达人绿色荧光蛋白的pTR-UF5(Peel等,1997)被用到所有包装实验中来优化该系统。这个pAVbgal载体质粒含有AAV TR，位于巨细胞病毒(CMV)早期转录启动子和E.coli b半乳糖苷酶基因的两侧。PAAV/Ad质粒被用来作为一个包装质粒与辅助质粒进行比较(Samulski等，1989)。pCDMrep质粒含有AAVrep基因，受CMV早期启动子的调控(Yang和Trempe，1993)。
19193bp的辅助质粒，pSH3和pSH5可以通过几个步骤来构建。一个1.5kb含有VAI和VAII基因的HindIII到SalI的片段(来自Ad5的nt9831-11555)被插入到pGEM3Z的同一位点产生pVA3。将一个5.8kb含有E2a基因的BamHI和EcoRI的片段(来自Ad的nt21563-27331)插入到pVA3的同样位点中产生pVA3E2a。来自pSub201的4.3kb XbaI片段(AAV2中的nt177-4471)，包含AAV rep和cap基因，随后被插入到pVAE2aE4的两个XbaI位点。其中一个pVAE2aE4上的XbaI位点位于E2a和VAI和II基因片段，另外一个位点(在Ad2基因组的nt10580)在VAI基因的上游被发现。两个版本的辅助质粒(pSH3和pSH5)区别在于4.3kb XbaI插入片段的方向，并在Fig.1B显示。 pSH3和pSH5辅助质粒保存在E.coli的HB101株中。质粒从500ml的细菌培养物中纯化出来，其分为4´125m，每个部分用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒的方法处理。 人293(Ad-5转化胎肾上皮)细胞和Hela细胞在补充有10%胎牛血清和抗体的EMEM中培养。细胞在37°C、5％CO2的单层培养基中培养。对照的包装实验感染倍数(m.o.i)为15的Ad5型在无血清培养基中培养1h，随即进行转染。Ad通过在Hela细胞上的噬斑形成滴定。 Fig.1. rAAV包装所用的质粒(A)pTR-UF5含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因和HSV－tk启动子(箭头)所驱动的neoR基因。整个构建的两侧有AAV TR元件(填充的方块)。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV启动子(箭头)所控制。转录盒两侧是AAV TR元件（填充的方块）。pAAV/Ad含有AAV rep 和cap基因，两侧是Ad末端重复元件（空方块）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4,E2a和VA RNA基因。两个质粒也含有AAV rep和cap基因。图下的数字指的是Ad和AAV基因组中的核苷酸数目。pSH3和pSH5的区别是在AAV DNA序列中的方向。为了清楚，质粒图谱的其余部分未列。
2.2. rAAV载体产生和滴定 对于小规模的包装实验，8´105 293细胞在35mm6孔盘上种植。24小时后，根据生产商的方法用lipofectamin（Life Technologies）一式三份转染培养物。对于开始的优化实验，所用的载体对辅助质粒的比例在表1列出。根据载体和辅助质粒的大小，1mg:3mg比例相应于1:1的pTR-UF5对pSH3/5的摩尔比。pAAV/Ad质粒与Ad共感染，3或5mg的pAAV/Ad与1mg的pTR-UF5共感染。pGEM3Z质粒(Promega)被共转染后保持不同转染的相同总DNA浓度。对于伴随Ad感染的转染，在加入DNA到细胞前病毒被吸附到无血清培养基中细胞单层上1h。转染后72小时，细胞被刮到2ml培养基中收获起来。细胞随后用1ml无菌PBS清洗。PBS清洗液加到细胞悬浮物中，冻融5次后超声破碎(3,36mm 45s)。提取物在4000´g离心10分钟去除细胞碎片，裂解液上清含有重组载体vAVgfp，它将被用到随后的转导中。在转导之前，这些转染的Ad用 56°C热处理30分钟。 对于大规模载体包装，20´1 125px的培养盘，每个含有5´106 293细胞，以及用钙磷酸盐沉淀方法(Wigler等,1979)转染了10mg pAVgal和50mg pSH3。72小时后，收获培养物，低速离心沉淀细胞，沉淀冻融4次，如前所述超声破碎。CsCl2加到裂解物中，终浓度为1.41g/ml，用折射指数确定。悬浮物在SW41转头上40 000rpm离心48小时。将含有可见载体的条带从梯度中去除，其密度可通过测量折射指数来确定。CsCl2离心步骤重复，获得的载体制备后进行透析，更换4次PBS，保存在－80°C。产生的载体vAVgal按下述方法滴定。 为了确定rAAV的滴度，4´104Hela细胞被种植到24孔培养盘中，感染m.o.i为10的Ad，用系列稀释的转染细胞裂解液进行转导。2、3天后，在广泛细胞病理效应被发现之前用带有EPI-荧光设备的DIAPHOT-***理光倒置显微镜在20倍下观察。计数产生良好分离的荧光细胞载体的稀释倍数。因而，每个阳性细胞代表了一个载体转导单位（T.U.）。为了确定rAAVgal载体的滴度，纯化载体的稀释液被用来感染细胞。细胞用PBS溶解的95％甲醇固定，用X-gal显色。每个蓝染的细胞代表一个载体转导单位(T.U.)。 载体基因组拷贝数用点印迹杂交分析来确定，如前所述方法测定A260(Fisher et al.,1996)。对于6孔盘的小规模包装实验，制备的原始载体用DNase I在37°C处理30分钟。DNase 在75°C灭活，蛋白质用50mM Tris 1mM EDTA 0.1%SDS 0.5mg/ml蛋白酶K在37°C消化12小时。对于CsCl2纯化的载体，使用相同的步骤，但不用DNase步骤。载体DNA煮沸5分钟，用Bio-Dot装置(Bio-Rad)加到硝酸纤维素膜上（Schleicher和Schuell）。每个孔用0.5M乙酸胺300ml(pH5.2)洗涤。洗涤印迹按照2.4部分 Southern blot方法处理，载体特异的探针标记，暴露于Kodak X-omat X线胶片(Eastman Kodak)。比较载体杂交信号与已知稀释浓度印迹到同样滤膜上的质粒DNA，精确估计基因组拷贝数。用Ambis Image Acquisition and Analysis系统定量杂交滤膜上的放射性和X-线胶片上的光密度。
2.3 蛋白质分析 为了分析AAV Rep和Cap蛋白质表达，按照2.2部分所述进行质粒转染。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，细胞低速离心沉淀收获。细胞沉淀在冰上用200ml STM-NP缓冲液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8.0,10mM MgCl2,0.5%NP-40,1.0mM PMSF, 0.1Mm DTT)中裂解。裂解物2000´g离心5分钟获得核沉淀。核沉淀在200ml IPP缓冲液中重悬，冰浴45分钟并经常涡旋。核抽提物在14 000´g离心去除DNA和核碎片。上清液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，100°C加热5分钟，14mA 10%SDS-PAGE凝胶分离过夜。用一个Trans-Blet SD 半干转移槽(Bi－Rad)转移蛋白质到硝酸纤维素膜上。滤膜在PBS溶解的2％奶粉阻断1-2h，随后用兔抗Rep（Trempe等，1987）或仓鼠抗Cap（American Type Culture Collection）一抗(含有1%奶粉的PBS稀释200倍)室温孵育2小时或4°C过夜。印迹用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤3次，每次10分钟。合适的碱性磷酸酶缀合的二抗用含有1％奶粉的PBS稀释2000倍，室温下孵育孵育印迹1小时。用PBS-Tween-20缓冲液洗涤3次，印迹用溶解在二甲基甲酰胺的NBT和BCIP染色5－20分钟。
2.4 DNA分析 为了分析病毒DNA，包装转染按照2.2部分所述进行。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg，低速离心收获。染色体外DNA用Hirt的方法(Hirt,1967)从细胞外分离。简单地说细胞沉淀在200ml裂解液(10mM Tris,pH8.0,1.0mM EDTA, 1.0%SDS)中重悬，加热40mg蛋白质酶K。37°C消化2个小时后，加入50ml 50M NaCl,冰浴4h。溶液在4°C 14000´g离心30分钟去除染色体沉淀。上清液用5ml RNase混合液(Ambion, 5mg RNase A,100单位RNaseT1)37°C处理2小时，用酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用氯仿抽提1次。DNA用2倍体积的乙醇沉淀，用DpnI处理去除输入的质粒DNA。DNA在琼脂糖凝胶 上分离，按上述方法转移到硝酸纤维素膜上(Hirt,1967)，用Stratalinker (Stratagene)将其UV交粘到滤膜上。滤膜用gfp基因特异的32P探针 或者AAV特异的探针杂交。如前所述进行杂交和洗涤。用随机标记试剂盒制备杂交探针。膜暴露于X线胶片。 为了估计rcAAV的量，1´106 293细胞感染了Ad（m.o.i）和CsCl2纯化的野生型AAV或vAVgal的稀释液。用pAAV/Ad或pSH3/5作为辅助质粒转染制备的vAVgfp原液被用来转导Ad感染的细胞。48小时后，培养物被收获，病毒DNA被制备并通过琼脂糖凝胶电泳和Southern 杂交分析。
3.结果
3.1 用AAV/Ad辅助质粒的rAAV包装 制备重组AAV载体的最常用的实验方案包括用含有目的基因、病毒TR元件的AAV为基础的载体质粒和提供Rep和Cap蛋白质的辅助质粒共转染Ad感染的组织培养细胞。一个最常用的辅助质粒是pAAV/Ad(Samulski 等,1989)。这个方法的主要缺点是在载体原液中污染Ad、生成能够复制的AAV，而且整个过程的低效率。为了克服这些问题，我们构建了一个新型的含有AAV rep和cap基因以及Ad E2a,E4和VA的辅助质粒。当质粒与高度易转染的293细胞系联合使用(Graham等,1977)时，它含有Ad E1a和E1b基因，所有包装rAAV载体所需要的成分都存在。为了测试这些质粒是否能够包装一个AAV为基础的载体，我们用表达绿色荧光蛋白的pTR-UF5（Peel等，1997）质粒和辅助质粒共转染到293细胞中(Fig1A)，用的是lipofectamine的方法。为了确定两个质粒的最佳比例我们使用了几个不同比例。作为对照，我们同样使用了Ad-5(15m.o.i)感染293细胞，然后用载体质粒和pAAV/Ad作为辅助质粒转染它们。72小时后，按2.2部分的方法收获细胞、裂解准备转导。裂解液一式三份被用来转导Ad感染的Hela细胞。绿色荧光细胞3天后用荧光显微镜计数。几个实验的结果在Table1.列出。很明显在这些包装效率与pAAV/Ad辅助质粒相比较的实验中，我们用pSH3和pSH5质粒获得了更多的rAAV。我们用辅助质粒常规地比pAAV/Ad和Ad感染获得更多的rAAV。每个细胞的最高产出135T.U.比pAAV/Ad对照所获得的高80倍。在其它载体质粒比辅助质粒更多的比例没有产生大量的rAAV。随后用点印迹杂交确定的基因组拷贝数目揭示了颗粒－感染比率对于表达gfp的载体在Ad感染的Hela细胞中大约是100。这样这些实验获得的最高得率大约是每个细胞1.36´104 DNase抗性基因组。这些实验表明了pSH3和pSH5质粒完全支持无Ad共转染情况下高效率的rAAV包装。
3.2. Rep和Cap蛋白质表达 为了表明辅助质粒能表达AAV蛋白质，293细胞共转染了TR-UF5和不同的辅助质粒，如2.2部分所述。将这些培养物转染48小时后收获、裂解并用SDS-PAGE和免疫印迹分析。用Rep特异性抗体分析Rep蛋白质的表达(Fig.2A)发现pAAV/Ad(4和5道)的表达显著低于pSH3(6和7道)或pSH5（8和9道）(1:3或1:5比例使用)的蛋白质水平。在Fig.2A中，我们只指出Rep78和Rep52的位置，因为Rep68与一个交叉反应蛋白质共迁移(在Rep78下可以看到)而Rep40的水平太低不能在核提取物中检测到。用Cap特异性的抗体分析Cap表达(Fig.2表明当使用pSH3和pSH5辅助质粒与pAAV/Ad相比Cap表达显著增高。正如所预料的，在pTR-UF5（第2道）和pCDMRep（第3道）转染的培养物中没有capsid表达。更高水平的Cap蛋白质可以解释为pSH3和pSH5产生的rAAV的产率显著高于pAAV/Ad的。其它表明Cap表达水平对于rAAV的产率是有限的(Vincent等,1997；Li等,1997)。尽管来自pSH3和pSH5的Rep78水平显著高于来自pAAV/Ad，但我们没有发现载体产率的减小。Rep78的过表达表明对rAAV的产出有限制(Li等，1997；Vincent等,1997)。另外，在pSH3和pSH5的AAV蛋白质表达方面没有显著差别。
3.3.病毒DNA分析 为了分析这些新包装质粒所产生载体的量和类型，我们共转染了pTR-UF5质粒和不同的辅助质粒，如2.2部分所述。转染48小时后，收获细胞，分离染色体外DNA。低分子量的DNA被DpnI(降解未复制的质粒DNA)消化。消化后的DNA用琼脂糖凝胶电泳和gfp特异的探针(Fig.3A)或AAV特异的探针(Fig.3进行Southern杂交。在所有含有Rep蛋白质的DNA样品中都发现存在AAVRFM和RFD (Fig.3A: 2－8道)。复制的载体DNA水平在pAAV/Ad（Fig.3A，3和4道）pSH3或pSH5（Fig.3A，pSH3 5和6道，pSH4 7和8道）被用作辅助质粒时几乎是相同的。一个相似的膜被探针探测找有复制能力AAV，当使用的是pAAV/Ad时(Fig.3B，3和4道)发现了复制的DNA，但pSH3和pSH5被用作辅助质粒时却没有发现(Fig.3B，5和6道)。这些结果表明pSH3/5辅助质粒完全支持AAV载体DNA复制，但是与pAAV/Ad辅助质粒相比产生的rcAAV较少。 3.4. 有复制能力AAV的分析 尽管pAAV/Ad和pTR-UF5之间没有显著的同源性，有复制能力的AAV能够通过载体质粒和pAAV/Ad中rep和cap基因两侧的Ad末端之间的重组生成(Allen等,1997；Wang等,1998)。为了评估从辅助和载体质粒共转染生成的rcAAV的水平，Ad感染的293细胞感染了不断增加的m.o.i的野生型AAV或rAAV-gfp载体。转导2天后，分离低分子量病毒DNA，用放射标记AAV探针Southern杂交分析。当106 293细胞被感染了m.o.i为10-3（大约104基因组）野生型病毒时， AAV DNA被发现(Fig.4, 2道)。当细胞转导以用pAAV/Ad包装质粒制备的rAAV-gfp时，复制能力的AAV也被发现(Fig.4, 7道)。在Ad感染的细胞传代一次后，来自一个pAAV/Ad包装实验的rcAAV数量在104和105颗粒之间(由基因组拷贝数目所确定)。然而，在4个不同小规模rAAV-gfp制备中没发现有复制能力的AAV(Fig.4，8-11道)。利用相同的分析方式，从20´375px培养皿大规模制备rAAV b-gal载体时也没有能够发现rcAAV(Fig4 12－17道)。从这些凝胶中最大量的gfp载体(8.0´108颗粒)和最低量的野生型AAV（104颗粒）的分析，我们估计rcAAV污染的量小于每8.0´104载体颗粒一个基因组或载体浓度的0.00125%。随后的小和大规模载体制备实验中，Ad感染的293细胞中2次传代后分析了rcAAV污染，结果没有检查到污染。
4．讨论
从AAV 获得的基因治疗载体正被广泛应用于各种获得性疾病和遗传疾病。AAV载体的增殖被生成载体所需的耗费体力的方法所阻碍。这里，我们描述了一种新型辅助质粒的构建和分析，它允许无Ad载体的生成，并显著增加了重组载体的得率。辅助质粒含有Ad的E4、E2a和VA RNA基因以及AAV rep和cap基因。当导入到Ad E1a/E1b转化的293细胞后，所有所需的Ad辅助基因都提供了，使有效的载体扩增和包装能够进行。相似的方法已经有报道，Ad的辅助基因由质粒转染而不是病毒感染所提供(Grimm等,1998；Matsu***a等,1998；Xiao等,1998b)。完全没有Ad的污染，且简化了载体的纯化。Grimm等(1998)描述了一个类似我们的Ad辅助质粒的构建并用于包装的步骤。 用这种新辅助质粒获得了载体得率的增加。我们已经获得了超过每个转染细胞100个gfp表达载体的转导单位。点杂交分析揭示这与每个细胞超过104载体基因组的得率相对应。我们认为从pAAV/Ad质粒改进的pSH3/5辅助质粒的载体包装系统是由于(1)更高水平的AAV蛋白质表达(Fig.2)和(2)只导入2个试剂(载体和辅助质粒)到培养细胞中而不是3个试剂(Ad感染，载体和辅助质粒)。我们的新质粒比pAAV/Ad表达更多的Cap蛋白质，它可能完全解释载体产量的增加。据报道，高水平的Rep78表达会抑制载体的生成(Li等，1997；Vincent等，1997)。然而实验中来自pSH3/5的Rep78积聚水平比来自pAAV/Ad 的高，但来自pSH3/5的载体产出却更高。很明显，来自pSH3/5增加的Cap表达足以克服Rep78的抑制。早期AAV的研究估计每个感染的细胞能产生105-106基因组和104-105组织培养感染单位(Parks等,1967；Rose和Koczot，1972)。因此具有有进一步改进此载体系统的潜力。一个可能增加载体产出的修饰是用ACG替代ATG启动密码子以减少Rep的表达，它可以有效地增加载体产出(Li等，1997)。 另外一个AAV包装系统困扰载体生成的局限性是rcAAV的生成。尽管在大多AAV载体和辅助质粒之间不存在大范围 (>8bp)的同源性，rcAAV仍然因为非同源性重组而产生(Allen等，1997；Wang等,1998)。我们的辅助质粒含有与野生型病毒相同的AAV的cap和rep基因。因而，有可能由于非同源性重组产生rcAAV。然而，对我们的小规模和大规模制备进行的分析都没有发现任何rcAAV。Fig.4所示的实验是在Ad感染的Hela细胞后传代1次获得的结果。随后，实验制备的载体在Ad感染的细胞中传2次代未发现rcAAV。没有rcAAV是这个系统的显著优势，因为rep基因表达的病毒能够影响体内的转导结果(Halbert等,1997)。 我们研制的辅助质粒包括了一些以前发表的包装系统的改进。我们剔除了Ad的颠倒末端重复序列，它在pAAV/Ad辅助质粒包装AAV载体时表明产生了rcAAV(Wang等,1998)。通过将AAV rep和cap基因组装到一个也含有Ad辅助基因的质粒上，我们无需象其它系统一样(Matsu***a等,1998；Xiao等,1998b；Grimm等，1998)需要一个3个质粒的转染系统。Grimm等(1998)研制了一个类似的系统在同一质粒上携带AAV和Ad早期基因，并产生了相似水平的载体。总之，我们开发了一个改进的质粒转染系统来生成重组AAV载体。载体生成的简捷、载体得率的提高以及没有rcAAV 或Ad污染使得这个系统对于临床前期筛选多载体构建特别有用。
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