哺乳动物细胞的RNAi技术策略(3)

5. si 表达框架
si 表达框架(si expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的si 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一个 pol III启动子，一段发夹结构si ，一个 pol III终止位点。和si 表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选si 的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和si 的最适搭配！如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的si 后，可以直接克隆到载体中构建si 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达si 和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。

Silencer Express si Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6启动子或者人源H1启动子元件可供选择，并已经过c-fos基因抑制的检验。
最适用于：筛选si 序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
三、si 的转染
将si 、si 表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导 I发生的关键。有许多转染试剂可供选用，最常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系，使用同一种转染试剂或方法，效果亦会不同。因此在实验过程中，有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度，转染的时间和si 与转染试剂的比例来评价。
四、实验对照设置
实验对照是衡量 i.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的si 转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的SI 浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性，且过多si 会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β―acion等）是较好的阳性对照，针对这些基因的高效SI 序列已有报道。阴性对照是用来检测 i的特异性。通常作为阴性对照的si 与选中的si 序列有相同碱基组成，但与靶m 无明显同源性。阴性对照的si 序列设计有2种方法，一是将特异性si 的序列打乱，即“零乱”si （scrambled si ），再对其进行BLAST比对，防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性；另一种是在特异性si 中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配，应需考虑它与突变m (即SNP位点)结合能力，最好在设计si 时就避免SNP区。
五、i效果检测
i效果可从m 和蛋白质两个水平来进行量化。在m 水平上，Northern Blot和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时，cDNA合成要用oligo(dT)，而不是随机引物，且预扩增片段最好位于靶m 序列中si 位点的上游。蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。 i一般在转染后24小时内发生，其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein)、si 在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。