人源抗体基因小鼠研发及其在治疗疾病中的应用（三）
2014年，科学家们应用细菌人工染色体（BAC）和Cre/loxP重组技术，在体外ES细胞系上，将人源抗体重链（V-D-J）可变区和轻链（Vk-Jk)可变区分别插入到小鼠重链恒定区（Cμ ）和轻链恒定区（Ck) 的上游区域，在不影响小鼠抗恒定区的基础上，成功构建了KyMouse小鼠模型。KyMouse小鼠在抗原刺激后，能实现体细胞高频突变发生，并产生高亲和力的人源抗体。
另外，科学家们通过构建一定数量的大片断人源抗体基因BAC，进行系列显微注射方法，将相应BAC载体导入小鼠ES细胞，实现人源抗体重链和轻链可变区基因定点替换相应小鼠抗体重链和轻链可变区基因，在保留小鼠抗体基因恒定区的基础上，成功构建了Veloclmmune小鼠模型。
目前，应用人源抗体基因小鼠技术平台研制治疗性抗体的生物医药企业主要有7家，包括，1. Cell Genesys/Abgenix公司研制的XenoMouse小鼠；2. Genpharm/Medarex公司的HuMAbMouse小鼠，该两家公司后来分别被 Amgen于 2005年和Bristol Myers Squibb于2009收购；3. Kymab公司的KyMouse；4. Regeneron公司的VelociMouse小鼠；5. Harbour Biomed 公司的H2L2小鼠；6. Trianni 公司的Trianni小鼠；7. Ablexis公司的AlivaMab小鼠。然而，目前获批的人源抗体也只是来自于XenoMouse、HuMAbMouse和VelociMouse三个基因小鼠技术平台。
到目前为止，由HuMabMouse小鼠平台研发并获批的人源抗体已有8个，其中两个抗体，抗CTLA-4抗体YervoyI和抗PD-1抗体 Opdivo，分别于2011年和2014年批准，都是首先用于黑色素瘤患者治疗。抗CTLA-4抗体能与免疫检查点抑制因子CTLA-4结合，抑制CTLA-4与APC细胞表面的B7结合，激活细胞毒T淋巴细胞活性，实现杀死肿瘤细胞的作用。同样，抗PD-1抗体与免疫检查点抑制因子PD-1的结合，阻止其对肿瘤特异性T细胞的免疫抑制效果，达到肿瘤治疗目的。HuMabMouse小鼠平台获批的两个抗IL-12亚单位p40和IL-23抗体，能阻止促炎反应信号作用，达到降低炎症反应的效果，用于临床上治疗自身免疫性疾病。此两个抗体分别于2009年和2016年获批治疗严重斑块状牛皮癣和克罗恩氏回肠炎。
由XenoMouse小鼠平台研发获批人源抗体已有7个。2006年第一个全人源抗EGFR抗体, 用于治疗EGFR表达（无KRAS基因突变）转移性结肠癌患者。该人源抗体是阻止EGFR与其配体结合，抑制EGFR信号通路，诱导肿瘤细胞的凋亡。另外有2个人源抗体用于治疗自身免疫皮肤相关性疾病；其中一个是人源抗IL-17抗体，具有降低牛皮癣患者的炎症反应作用。另外一个是人源抗IL-17受体抗体，发挥抑制IL-17家族细胞因子的作用。它们分别于2015年和2017年获得美国FDA批准，用于临床治疗牛皮癣患者。
作为第二代人源抗体基因Veloclmmune小鼠技术平台，已获得包括抗IL-4受体抗体、抑制IL-4和IL-13信号通路、以及抗IL-6受体抗体4个人源抗体药物。2017年获批的抗IL-6受体抗体，通过抑制IL-6信号通路，降低肝细胞释放炎症相关因子，实现治疗风湿性关节炎等自身免疫性疾病作用，并被认为在治疗新冠肺炎疾病中，该类抗体可能具有缓解由病毒引起的炎症因子风暴的作用。
五、人源抗体研发未来发展的趋势？
治疗性抗体研发领域这几年发展非常迅速，已经成为药物研发市场的主力军。然而，治疗性抗体领域仍有巨大发展与应用潜力。传统意义上讲，抗体药物主要应用于肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等临床治疗。如果我们可以深入阐明某些特异蛋白或分子参与某些特殊疾病致病过程的分子机制，将有助于研发应用范围更广、更加有效和特异性的治疗性抗体。
治疗性抗体研发未来发展趋势可分为两大种类型，第一类型为直接应用于治疗疾病的所谓裸抗体（naked antibady), 比如，治疗肿瘤抗体，就是通过介导ADCC/CDC等相关通路，直接攻击肿瘤细胞，引起细胞的凋亡，或者攻击肿瘤细胞生长微环境，或攻击免疫检查点分子等。在此类抗肿瘤过程中，抗体是通过招募自然杀伤细胞或其他免疫细胞，发挥消灭肿瘤细胞的作用。
第二类型抗体药物是通过对抗体的进一步加工修饰，达到增加其治疗疾病价值的目的。通常应用的抗体修饰方法与策略包括，抗体-免疫细胞因子结合、抗体-化学药偶联物、抗体-放射核素结合物、双特异性抗体、免疫脂质体、和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗等。抗体-免疫细胞因子结合，目的是通过抗体与特定细胞因子的融合，以增强细胞因子传送的特异性。抗体-药物偶联物是由能特异性识别肿瘤靶点的抗体与小分子药物相结合，从而增加了小分子药物作用的特异性与有效性，降低了其对非靶点细胞的毒性作用。抗体与放射核素的结合，也增加了放射疗法特异性治疗肿瘤作用。
最近，双特异性抗体研发为抗体治疗提供了具有巨大吸引力的新策略和新机会。双特异性抗体是借助蛋白质工程技术，将两个抗原结合域（如Fabs/scFvs)相互连接起来，使一个抗体可同时识别两个不同的抗原。因此，借助基因编辑技术方法，让一个抗体发挥治疗疾病的新功能，而不仅仅是原来两个抗体简单的混合体。多数双特异性抗体的设计策略是基于结合免疫系统中，针对致病靶点的两个细胞毒效应细胞来设计的。目前，已有两个双特异性抗体进入临床应用，一个是针对靶点CD3和CD19抗体，治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL），另外一个是针对活化血凝因子IX和X的双特异性IgG抗体，用于治疗A型血友病。同时，有近85个双特异性抗体进入临床试验，约86%为评价抗肿瘤治疗效果的双特异性抗体。
早期针对治疗性抗体的研发集中在如何提高抗体结合、功能与药物特征等更适合临床应用方面，比如，如何提高抗体可变区人源化程度及其亲和力成熟，或者研制具有治疗效果不同的抗体片断（Fab和scFv) 等。随后，这方面的研究开始转向如何改善抗体的Fc功能，比如，如何提高抗体的ADCC、ADCP（抗体依赖细胞吞噬作用）、CDC、或灭活Fc功能等方面。抗体Fc工程成为增强抗体特异性活性和延长其有效期非常重要的工具，可实现降低抗体药物使用量和潜在副作用的目的。
另外，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，则是另外一种抗体与T细胞相结合的技术应用。通过将T细胞靶向特异性目标，实现破坏肿瘤细胞的目的。CAR-T细胞是将抗体可变区（比如scFv) 与T细胞的激活相关分子融合构建而成。2017年，FDA批准了第一个CAR-T细胞治疗药物，用于临床治疗急性淋巴性白血病（ALL）以及成年大B细胞淋巴瘤。
从单个B细胞分离筛选研制人源抗体也是目前该研发领域的新趋势，且有可能成为针对感染性疾病治疗的新兴研究领域。经过EBV转染单个B细胞永生化过程等方式研制人源抗体技术的优势，在于只需要少量人体外周血细胞，快速分离克隆潜在高效的人源抗体。面对新型病原致病因子的危险，比如最近出现的新冠病毒感染疾病，快速研发具有免疫治疗或多样性组合抗体库就更加具有其现实意义。而单个B细胞分选技术则是实现该研发目的最为理想的选择。虽然，目前应用单个B细胞方法已成功研制出抗病毒的人源抗体。比如，抗登革热病毒、抗Zika病毒、抗Ebola病毒、抗HIV病毒和抗呼吸道合胞病毒（RSV）的人源抗体。其中许多此类人源抗体目前分别进入不同阶段（I/II/III期）的临床试验。
然而，目前为止，还没有FDA批准的由单个B细胞技术研发的人源抗体进入临床应用，该技术仍面临需要克服相关问题的挑战。比如抗原标记技术、分选抗原配置、以及克隆抗体引物设计等。结合新一代NGS测序技术，新诊断、药物代谢动力学应用和临床治疗方面的进展，单个B细胞技术研制人源抗体也将成为一个非常有力的工具，实现寻找与发现具有稀有特征的治疗性抗体，以满足未来新一代治疗性抗体研发的设计需求与目标。
近年来，临床上应用多个抗体组合的策略（抗体鸡尾酒疗法）治疗疾病，也被认为是抗体治疗某些特殊疾病的发展方向。此种所谓的抗体鸡尾酒疗法，起初主要基于是针对肿瘤或感染性疾病中，同一靶点的不同抗原表位的策略。该种疗法有利于潜在降低抗体使用量的同时，增加多个抗体协同作用，达到提高治疗疾病有效性和安全性的目的。所以，抗体鸡尾酒疗法的开发，既发挥了各个抗体的特异性、质量可控、副作用低等优点，又兼顾了多抗结合位点多、亲合力强、逃逸可能性低等长处，成为人源抗体药物研制的有利补充。
另外，在已成功建立人源抗体基因小鼠技术平台基础上，对其他非传统的人源抗体基因小鼠技术平台也受到人们一定的关注，比如，有利用于多特异性人源抗体研发的技术平台，包括只含重链的 HCAb (Harbour BioMed)或只含轻链（OmniFlic) 的人源抗体基因小鼠模型，以及建立其他类似的基因动物模型，比如，人源抗体基因大鼠模型（OmniRat®）、人源抗体基因鸡模型（OmniChicken™）和人源抗体基因牛模型（Tc Bovine™）等相应技术平台。
六、抗新冠病毒人源抗体研发目前有哪些进展？
针对当前面临的新冠肺炎全球大流行的挑战，全球科学家们也正在应用单个B细胞分离筛选与人源抗体基因小鼠等技术平台，加速研制针对新冠病毒的人源中和抗体，希望早日成功应用于抗新冠肺炎治疗。比如，Eli Lilly公司研发的抗新冠病毒中和抗体（LY-CoV555）是全球首个进入临床试验的抗新冠病毒抗体药物。国内的君实生物研制的抗新冠病毒抗体（JS016）也宣布进入临床试验。Eli Lilly和君实生物研发的抗新冠病毒中和抗体都是来自新冠肺炎康复患者外周血分离的单个B细胞。
另外，中国科学院微生物研究所为主导的研究团队最近报道，从新冠肺炎康复患者体内分离鉴定到的几十株全人源抗体基因，最终筛选获得两株理想的特效抗体，具有高效中和新冠病毒的活性。恒河猴新冠病毒感染模型研究证实，该两株人源抗体能有效地阻断新冠病毒的感染，显著降低了恒河猴呼吸道中新冠病毒的载量，保护由病毒感染造成的肺部损伤。目前该人源抗体也已进入临床试验。
考虑到新冠病毒已发生突变及抗体药物临床使用潜在逃逸风险的因素，国内外不少研究团队将抗体鸡尾酒疗法放在了新冠病毒中和抗体药物研发的首位。再生元（Regeneron）公司应用其VelocImmune人源抗体基因小鼠平台，结合康复患者外周血分离的单个B细胞分离技术，开发了两个中和活性高，且无竞争的抗新冠病毒抗体。临床前研究表明，由此两种人源抗体组合的抗体鸡尾酒疗法，具有中和目前已知的新冠病毒突变毒株的作用。由于该两种抗新冠病毒抗体与刺突蛋白S的受体结合域（RBD）结合为非竞争性，从而可降低突变病毒逃逸抗体治疗的几率。该抗体鸡尾酒疗法最近进入临床试验III期。
和铂医药（Harbour BioMed）也是最早研制抗新冠病毒感染抗体的公司之一。应用其H2L2全人源抗体基因小鼠技术平台，筛选出一株有效抵抗新冠病毒感染的人源抗体。由于该抗体靶向新冠病毒和SARS病毒共用的保守表位，因此，该抗体有望对同亚属的冠状病毒同时发挥预防和治疗的作用。研究者认为，由于这款抗体对病毒的中和能力并不依赖于抑制新冠病毒RBD与ACE2受体的结合，所以，该抗体有望和其他针对新冠病毒受体结合的抗体组合应用形成“鸡尾酒疗法”，产生协同抗新冠病毒感染的作用。
目前，根据全球新冠抗体药物数据库资料表明，有超过百种的抗体药物疗法，其中传统抗体形式占到约81%，其他为各种形式抗体药物（比如单域抗体、融合抗体和单克隆抗体等）及相关药物，覆盖了抗新冠肺炎从早期感染到全身性器官衰竭（比如包括抗细胞因子风暴反应的抗体IL-6R、GM-CSF和C5等）靶点相关抗体药物。新冠病毒刺突S蛋白则是研发相应中和抗体最受关注的靶点，而目前针对抗新冠肺炎治疗性抗体研发的技术策略，则是以单个B细胞分离筛选技术为主，以及应用人源抗体基因小鼠模型和噬菌体展示等技术平台。现在绝大部分相关抗体药物的研发仍处于临床前，有接近20%的抗体药物已进入临床试验。
人源抗体研制已显示了其作为神奇子弹的高效性与特异性，虽然在实际临床应用中，仍难以避免一些副反应的发生。比如，从短暂的抗药物抗体（ADA）的出现，到严重的瘫痪和药物清除障碍等。相信随着抗体研制新技术与策略的不断发展与完善，将会促进人源抗体研发，扩大抗体药物治疗多种人相关疾病的范围，让更多不同疾病患者受益。
