核酸的纯化主要方法和分离纯化核酸时的注意事项(一)
分离纯化核酸时的注意事项:
防止物理因素的降解:
1.尽量简化操作步骤,缩短提取时间,以减少变性机会。
2.防止热变性,避免高温。一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用 动作轻缓;搅拌温和;加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解:
1.避免强酸强碱作用,抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度,以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解:通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶
2.去垢剂及某些RNase抑制剂,对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解:RNase很难抑制,且无处不在,汗液、唾液中均有。很耐热,80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项:
1.带一次性手套、口罩;
2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC(乙二基焦炭酸)处理。但含有Tris的试剂不宜用,因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质(含RNase),并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有:
1.核糖核酸酶阻抑蛋白(RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白)优点:效果好,不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项:(1)置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DDT)的50%甘油中,-20℃储存。(2)最大活性的发挥要求有巯基试剂。(3)冻融数次后应弃之不用。(4)在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用,在其后RNA纯化步骤中应用。用酚抽提可除去蛋白质抑制剂,故纯化过程中应补加。
2.糖核苷复合物(vanadyl-ribinucleasidecomplex)由氧钒(IV)离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物,是一种过渡态类似物,它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点:强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。可用0.1%羟基喹啉的苯酚(用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡)多次抽提除去。
3.硅藻土(Macaloid):是一种粘土,能吸附多种RNA酶。用缓冲液以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞,这种粘土同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中经离心除去。
4.皂土:一种无机物,与酶结合可使其失去活性。
5.DEPC(焦炭酸二乙酯)
6.肝素(heparin)
7.去垢剂主要分为阴离子型去垢剂、阳离子型去垢剂和非离子型去垢剂三类,近几年又出现了双性离子去垢剂。其作用为:①溶解膜与质膜②使蛋白质变性与溶解③对RNase和DNase有一定的抑制作用④乳化剂去垢剂的效果和作用时间有关,一般以高浓度、短时间为好,因为这样核酸分解较少。常用阴离子去垢剂:①SDS ②LDS ③Sarkosyl ④DOC ⑤4-氨基水杨酸钠 ⑥萘-1,5-二磺酸钠 ⑦三异丙基萘磺酸钠
8.胍类:常用的有盐酸胍和硫氰酸胍,蛋白质的强烈变性剂,能迅速溶解蛋白,导致细胞结构破碎,核蛋白(RNP)由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。
9.RNA酶作用底物:加入小分子的RNA作为RNA酶的底物,可减轻对RNA的水解作用。
10.多胺(polyamine):反应可逆,抑制不完全。