小麦种子直接PCR
实验概要
本实验提供了小麦种子直接PCR的几种方案。
实验原理
小麦是世界第二大粮食作物，仅次于玉米，作为人类主食之一，对于小麦的研究由来已久。现在利用现代分子生物学手段改良小麦种子，筛选优良品种成为各大种子公司研究机构的首选。另外由于现今转基因植物的广泛应用以及外来生物入侵，海关检验检疫部门对于转基因，病虫害检测方面也需要一些快速高效的检测手段。
Omega Bio-Tek Seed Direct PCR kit能够快速，准确，高效，安全的从各种干燥或者新鲜植物种子中制备高质量的基因组DNA用于快速的PCR检测，特别适合各种高通量快速检测实验。
实验步骤
1. 完全不用离心和研磨操作，也不用长时间浸泡种子，只需将一粒完整的种子在裂解液中消化1-2小时即可以用来PCR检测。（材料：新鲜或者放置不超过一年的小麦种子样品）
方法：
1) 取1粒小麦种子放入2ml离心管中，加入95ul PS1和5ul PS2，56℃水浴1-2小时。
2) 将样品置于90℃水浴5min，冷却后加入100ul PS3，短暂涡旋20秒。所得抽提液可直接作为PCR反应的模板。
注：如果样品较多，可以先将PS1和PS2按比例混合，再分装到每个样品管中。客户也可以使用PCR管或者96孔PCR板代替2ml离心管，直接在PCR仪上加热。
结果：
1) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作为50ul体系PCR扩增的模板，以植物ITS1为目标基因（上游引物：5’-AGAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’, 下游引物：5’-TCTCCGCTTATTGATATGC-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35个循环扩增约650bp左右的片段，取10% PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如下。结果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因组DNA完全可以用于PCR反应，扩增出来的目的条带清晰，大小一致。
2) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作为50ul体系PCR扩增的模板，以小麦alpha-type gliadin 为目标基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35个循环扩增766bp的片段，取16% PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如下。结果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因组DNA完全可以用于PCR反应，扩增出来的目的条带清晰，大小一致。
2. 完全不用离心和研磨操作，也不用长时间浸泡种子，只需将一粒完整的种子在裂解液中消化1小时，加入蛋白酶后稍微戳破小麦种子表皮，再消化1小时左右即可以用来PCR检测。（材料：超过两年并且特别干燥的小麦种子）
注：此类种子由于放置时间较长，表面DNA氧化降解严重，需要稍微破除表皮才能获得较完整的基因组DNA。
方法：
1) 取1粒小麦种子放入2ml离心管中，加入95ul PS1，60°C水浴1小时。
2) 加入5ul PS2，并用枪头稍微戳破小麦种子表皮，涡旋30-60秒，56°C水浴1小时。
3) 将样品置于90°C水浴5min，冷却后加入100ul PS3，短暂涡旋20秒。所得抽提液可直接作为PCR反应的模板。
注：如果样品较多，可以先将PS1和PS2按比例混合，再分装到每个样品管中。客户也可以使用PCR管或者96孔PCR板代替2ml离心管，直接在PCR仪上加热
结果:
1) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作为50ul体系PCR扩增的模板，以小麦alpha-type gliadin为目标基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35个循环扩增766bp的片段，取16% PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如下。结果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的基因组DNA完全可以用于PCR反应，扩增出来的目的条带清晰，大小一致。而使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案一抽提得到的基因组DNA用于PCR反应时有一些样品不能得到扩增。
2) 取5ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提的DNA作为50ul体系PCR扩增的模板，以小麦alpha-type gliadin为目标基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35个循环扩增766bp的片段，取16% PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如下。结果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的基因组DNA完全可以用于PCR反应，扩增出来的目的条带清晰，大小一致。
3. 分别取1ul-10ul E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit方案二抽提得到的DNA作为PCR模板，以小麦alpha-type gliadin 为目标基因（上游引物：5’- AGACCTTTCTCATCCTTGCC-3’,下游引物：5’- TTCCTTATTTCCTCGAACTGG-3’），Omega 2×Taq Master Mix 35个循环扩增766bp的片段，取16% PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果如下。结果表明，使用E.Z.N.A. Seed Direct PCR Kit抽提得到的基因组DNA足够用于PCR扩增，且细胞裂解释放的抑制因子经过PS3 Buffer中和以后对PCR不再有抑制作用，扩增出来的目的条带清晰，大小一致。
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